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靶向VEGF和VEGFR2的shRNA在抗肿瘤研究中的应用

张敏  
【摘要】:血管新生是肿瘤生长、发展的必经之路,与实体瘤的发生、转移有着密切的关系,许多肿瘤仅在新血管生成后才出现临床症状。因此,针对肿瘤进行抗新生血管治疗具有重要的学术意义和临床应用价值。VEGF是主要的新生血管刺激因子,它与细胞表面的受体结合,通过旁分泌和自分泌的方式来促进血管的生成。1998年发现的RNA干扰技术已成为继反义核酸后发展起来的一项高效特异抑制基因表达的新技术。本研究选择采用RNA干扰技术探讨靶向VEGF及其受体VEGFR2的shRNA载体的构建及其抗肿瘤活性,并讨论VEGF在肿瘤发展中的重要作用。 一、靶向VEGF的稳定干扰质粒的构建及其抗肿瘤活性研究 由于shRNA非病毒表达载体转染效率相对较低,而且瞬时转染质粒DNA可能在细胞内促发干扰素效应,引起非特异性毒性,造成非靶基因特异的功能改变,因此我们设计构建了应用于基因功能研究的shRNA非病毒表达载体pCD-shRNA,尽量避免上述问题的出现。载体采用pcDNA3.0的基本质粒序列,删除其原有的CMV启动子避免干扰,连入了RNA聚合酶Ⅲ可识别的、用于起始shRNA转录的H1启动子,该载体插入表达shRNA的DNA序列后可在哺乳动物细胞内稳定转录出shRNA,实现靶基因的长效抑制。 根据siRNA的设计原理,我们选择VEGF mRNA上四个不同靶位作为siRNA切割位点,合成四对DNA引物,连入载体。瞬时转染细胞后,ELISA分析发现四个质粒都可以降低细胞内VEGF的表达,但降低程度不一。选择抑制效果最佳的质粒pCD-V382,进行后续的研究工作。 将pCD-V382转染人纤维肉瘤HT1080细胞,经G418筛选得到单克隆,扩大培养后,采用ELISA和Western Blotting对细胞培养上清和细胞总蛋白中的VEGF量进行检测,选择表达量最低的HT1080-V3细胞株进行深入研究。


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