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脂蛋白代谢中活性蛋白的结构与功能

周冰  
【摘要】:第一部分 不易感动脉粥样硬化动物树鼩ABCA1的克隆、表达及组织分布 ABCA1(ATP-binding cassette transporter A1)是参与体内脂质代谢的主要成分之一,其在胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport,RCT)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)生成的起始步骤中起重要作用,被称为RCT的守门人。 树鼩被认为是具有特殊脂质代谢机制的不易感动脉粥样硬化动物,但其不易感动脉粥样硬化的机制目前尚不了解,为深入探讨该动物不易感动脉粥样硬化的原因,我们课题组目前已经成功克隆了树鼩下列几种与脂蛋白代谢相关的基因,如APOAI、APOCI、APOE、APOCII、PLTP、LCAT、APOAV和CETP等,初步分析了它们的结构特点,并与人以及其它动物的相同基因进行了比较。为了更全面的了解树鼩脂代谢中其它相关基因的结构特点及其在代谢中的作用,我们对树鼩ABCA1基因cDNA全长和蛋白序列以及组织分布进行了初步研究,并在原核细胞中表达了树鼩ABCA1蛋白,以便进行功能研究。 树鼩肝组织总RNA使用Trizol试剂提取,经过PolyATract~(TM)mRNA磁珠分离纯化系统处理,得到了高纯度的mRNA,经逆转录合成cDNA第一链。在比较了人、大鼠和小鼠ABCA1基因cDNA序列的基础上,在高度保守的区域设计引物,进行PCR扩增。扩增的目的片段,经过内侧引物鉴定后克隆到T-easy载体。通过转化感受态细胞,挑选、鉴定阳性克隆,以便进行序列测定。将序列测定结果进一步与人、大鼠、小鼠ABCA1基因的cDNA序列进行同源性分析以确定是否为目的序列。通过上述方法得到尽可能长的cDNA序列,以利以后的实验。在已经获得的cDNA序列中,设计5’和3’快速扩增cDNA末端的特异性引物,利用RACE试剂盒得到5’和3’端完整的cDNA第一链,并以此为模板,


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