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《中国协和医科大学》 2002年
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异质性胞核核糖核蛋白A2(hnRNP A2)与抗hnRNP A2/RA33抗体在类风湿关节炎发病机理与临床诊断中的研究

杨玲  
【摘要】:异质性胞核核糖核蛋白(hnRNP)是mRNA成熟加工过程中重要的核酸结合蛋白,也是风湿性疾病中免疫应答的靶抗原,抗hnRNP抗体具有疾病特异性。类风湿关节炎(RA)患者血清中的抗hnRNP抗体主要是能与hnRNP A2特异性结合的抗体,该抗体又称抗RA33抗体。抗hnRNP A2/RA33抗体不仅是有价值的诊断指标,而且在风湿性疾病的发病机理中也具有重要意义。 本研究首先从小鼠Ehrlich腹水瘤细胞核中提取RA33粗抗原,用肝素-琼脂糖凝胶CL-6B层析柱进行初步纯化,初纯抗原经SDS-丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示:蛋白条带较粗抗原明显减少,主要在33 kD附近有清晰明显条带,免疫印迹法证实初纯抗原与抗RA33抗体阳性血清发生特异性反应。为了进一步研究RA33抗原与抗RA33抗体,我们利用杂交瘤单抗制备技术,用RA33初纯抗原免疫Balb/c小鼠,ELISA和免疫印迹法筛选阳性克隆得到三株能稳定分泌小鼠IgG1型单抗的杂交瘤细胞株并对其性质进行了初步分析。 因为抗RA33抗体针对的抗原主要是hnRNP A2,所以本研究利用基因工程技术通过构建含hnRNP A2cDNA片段的基因克隆,制备并纯化重组蛋白hnRNP A2。首先从正常人外周血单个核细胞提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增hnRNP A2cDNA,将其克隆于PUC-T1质粒中,测序证实该片段为hnRNP A2的编码序列。然后,将含hnRNP A2cDNA片段的重组质粒和表达载体pET-28a酶切后进行连接反应,构建高效重组表达载体pET-28a-hnRNP A2,转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S获得了hnRNP A2的高效表达。再将含目的蛋白的组分经金属螯合树脂进行亲和层析得到高纯度的、具有抗原反应性的重组蛋白hnRNP A2。 为了探讨hnRNP A2与抗hnRNP A2/RA33抗体在RA发病机理中的作用,本研究采用免疫细化和原位杂交方法,分别利用单克隆抗体和特异的cDNA探针,检测滑膜组织中hnRNPA2的表达水平,结果表明hnRNP A2在RA患者滑膜细织中的表达水平较骨关节炎(OA)和
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R593.22

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1 杨玲;异质性胞核核糖核蛋白A2(hnRNP A2)与抗hnRNP A2/RA33抗体在类风湿关节炎发病机理与临床诊断中的研究[D];中国协和医科大学;2002年
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