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乙型肝炎病毒包膜M蛋白的表达与免疫原性研究

丁云菲  
【摘要】:乙肝病毒(HBV)包膜蛋白由3个区域组成:与肝细胞直接作用的含有108或119个氨基酸残基的preS1,通过多聚白蛋白间接与之作用的含有55个氨基酸残基的preS2区域,和含有226个氨基酸残基的S蛋白区。许多研究证明,带有preS1和preS2序列的乙肝表面抗原(HBsAg)有望成为新一代更高效的乙肝疫苗。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近年兴起的一个重组蛋白生产系统,以其独特的优势在生物工程应用中不断得到推广。本论文就HBV包膜M蛋白在原核大肠杆菌(E.coli)和真核Pichia系统的表达、性质鉴定及免疫原性等进行了系统详细的研究。 在原核系统中表达preS2多肽,为HBV包膜M蛋白的活性检测提供材料。将人工合成preS2的全基因插入E.coli表达载体pThioHisA,以硫氧还蛋白融合蛋白的形式实现高效表达。经渗透压处理初步纯化蛋白,获得了具有preS2抗原性的thioredoxin-preS2融合蛋白。 为了在Pichia系统中高效表达HBV包膜M蛋白,用限制性内切酶SacI+SalI消化质粒pPIC3.5k和pAO815,替换对等部分,组成新的毕赤酵母高拷贝整合型表达载体pAO818。用它构建表达HBV包膜S蛋白的重组质粒,获得稳定的高表达。证实新载体改建成功后,将M蛋白编码基因插入酵母整合型表达质粒pAO818的醇氧化酶(AOX1)启动子下游,构建携带8拷贝M表达盒的重组载体,经电转化SMD1168菌株和G418筛选,得到了高效分泌表达M蛋白的毕赤酵母菌株,表达量达到50mg/L。通过CsC1等密度梯度离心的初步纯化,分泌型重组M蛋白具有preS2和S抗原性,可以形成大小在22nm左右的颗粒,并具有一定程度的糖基化。 E.coli系统表达的thioredoxin-preS2融合蛋白和Pichia系统分泌表达的HBV包膜M蛋白颗粒的免疫原性研究表明,实验组小鼠均出现抗-preS2阳性,其抗体水平明显高于对照组;与细胞免疫相关的γ干扰素水


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