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《中国协和医科大学》 2002年
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基因治疗促进皮瓣血运重建的实验研究

王法刚  
【摘要】:基因治疗是二十世纪九十年代以后才逐渐发展起来的一种全新的治疗手段,与传统的利用蛋白质类药物不同,它是将外源性核酸等遗传物质导入人体。利用其矫正特定基因的缺陷或调节某种蛋白的表达,来达到治疗某种疾病的目的。目前基因治疗的实验研究几乎涉及到医学的各个领域,尤其在遗传性疾病、癌症、心血管疾病治疗等方面,取得了令人振奋的成果,但在创伤治疗、组织移植领域这方面的研究尚少。VEGF基因是心血管性疾病基因治疗实验选用最多的目的基因,实验证实外源基因转染心肌、骨骼肌后能够促进局部血管的增生,而血管增生、血运重建也是创伤愈合、组织移植过程中所关心的问题。本实验的目的正是借助于皮瓣,探索VEGF基因治疗在组织移植领域的应用。 本实验利用PCR技术,自人胎肝cDNA库中钓取VEGF165基因片段,将之连接进质粒pUC19中,在工程菌E.coli DH5α中进行扩增,纯化后进行DNA测序,筛选出序列正确的单克隆。选用质粒pcDNA3.1/zeo(+)作为真核细胞表达载体,将经测序证实序列正确的VEGF165 cDNA片段进行体外重组,重组质粒在工程菌E.coli DH5α中大量扩增,QIAGEN去内毒素质粒提取纯化试剂盒行质粒的大量提取。重组质粒在阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导下转染体外培养的哺乳动物细胞293,分别收集转染后24小时、48小时、72小时的细胞和培养液,行SDS-聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳,硝酸银染色及Western blotting检测VEGF的瞬时表达情况。将pcDNA3.1/zeo(+)-VEGF165与阳离子脂质体Lipofectamine 2000按一定比例混合,注射到Sprague-Dawley(SD)大鼠背部皮下,定期切取注射区域皮肤及皮下组织标本,行免疫组化检查,以直观显示VEGF165的表达情况,常规HE染色,观察皮下血管的密度及毛细血管增生状态,并以测微器行皮下组织血管计数,了解局部血管的变化趋势。以小型猪为实验动物,建立猪背部随意皮瓣模型,每侧掀起3个4cm×16cm的蒂在上的随意皮瓣,右侧的3个皮瓣作为实验组,皮瓣皮下注射重组质粒与脂质体的混合物,左侧的3个皮瓣作为对照组,注射相同体积的生理盐水,术后第10天,测量皮瓣的成活长度,观察两组之间的差异,SPSS对之进行统计分析。 实验结果显示:选用合适的引物及退火温度,可以在人胎肝cDNA库中克隆出VEGF165 cDNA片段,它含有完整的开放阅读框。由此而构建的重组质粒表达载体系统pcDNA3.1/zeo(+)-VEGF165在体外表达实验中,Western blotting检测到特异性条带,说明该系统能正常工作。 在动物实验中,大鼠皮下注射重组质粒与脂质体的混合物,术后1日,应用抗人-VEGF165单克隆抗体行免疫组化检查,即可检测到人VEGF165的存在,而以术后一周内最明显,可以持续到术后20日;与之相对应的是皮下组织中新生血管增多,
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R450

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