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《中国协和医科大学》 2002年
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用改进的RERS方法富集与筛选Apo(a)-Plasminogen基因簇中的调节片段

吕湘  
【摘要】:面对气象万千的外部环境和自身分化、发育的需要,细胞中必然存在一个极为精密的表达调控网络,时刻监测外来和自身因素的变化并作出反应,实现基因间协调有序的关系,维持细胞乃至个体的稳定状态和发展的需要。了解这个网络的结构组成、各组件间相互识别的方式及其变化,是后基因组时代的主要任务之一。 转录水平的调节是基因表达调控网络中最重要的环节。已有研究表明DNA顺式作用元件与反式作用因子之间的相互作用是染色质重塑和基因转录调节的基础。筛选、鉴定基因组中的调节片段和它们相应的DNA结合蛋白,阐明这些元件的结构与功能关系,是基因调控研究的主要内容。 现有的研究方法难以大量筛选、鉴定DNA调节元件,它们在筛选DNA调节片段时,或者效率不高,不能快速、大量地筛选基因组中的DNA调节元件,或者需要纯化的转录因子和抗体,只能分离与已知蛋白质结合的DNA片段。另外,由于转录调节因子在细胞中的表达水平极低,利用常规的纯化方法很难获得足以进行氨基酸序列分析或抗体制备的纯化蛋白质。目前已克隆的转录因子不多,对这些因子的表达模式和DNA—蛋白质相互作用规律尚缺足够的研究。因此,建立一种能在大范围内高效筛选和鉴定DNA调控元件的方法,仍然是目前转录调控研究的当务之急。 本实验室在对原有的全基因组PCR技术进行改进的基础上,结合凝胶阻滞实验,建立了筛选DNA调节片段的新方法(Rapid Enrichment and selection of Regulatory Sequence,RERS)。其基本原理是通过超声将基因组DNA随机打断,与DNA连接子相连后进行全基因组PCR扩增、标记,回收200bp左右的DNA片段作为探针,与K562细胞粗提物结合后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,回收阻滞带DNA再次进行PCR扩增,作为新一轮凝胶阻滞实验的探针,与核粗提物再次进行凝胶阻滞实验。如此重复多轮,不断富集可与K562细胞核粗提物结合的DNA,建立富含调节片段的DNA部分文库,从中筛选出能与核蛋白特异结合和具有细胞特异结合模式的DNA调节片段。与其它已有的方法相比,这种方法具有以下优点:1) 能快速、大范围地富集、筛选基因组中的调控片段。2) 能筛选具有细胞特异结合模式的DNA调节片段。3) 操作简单,不需要纯化的转录因子或相应的抗体,也不用其它特殊材
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q7-33

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