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《中国协和医科大学》 2002年
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胞膜-6A8-α-甘露糖苷酶

王壮志  
【摘要】:6A8 cDNA是本实验室克隆到的,长3300bp,从57-3242bp为一开放阅读框架,同源性分析高度提示6A8 cDNA编码的蛋白质可能是一种α-甘露糖苷酶。另外,用于克隆6A8 cDNA的单抗是用活的人B细胞3D5免疫小鼠,并用活3D5细胞作靶细胞筛选到的,因而提示6A8 cDNA编码的蛋白质可能也表达于细胞膜。本论文工作的目的就是:1)确证6A8蛋白质为一种α-甘露糖苷酶;2)6A8蛋白质在细胞中的定位,检测它是否也表达于胞膜,是一种胞膜酶。 为了确证6A8蛋白质的α-甘露糖苷酶本质,我采用分子克隆重组技术将本室克隆到的3个6A8 cDNA片段连成一个完整的3300bp cDNA,经测序完全正确,再将它插入真核表达载体pCDNA3中,在COS-7细胞中获得瞬时表达。以野生型及转染空载体的COS-7细胞作对照。观察到转染6A8 cDNA-pCDNA3的COS-7细胞蛋白匀浆上清液对p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside的酶解作用增强,且不被swainsonine抑制。用单抗6A8作探针行Western Blotting,见分子量为120KDa的蛋白带,转染6A8 cDNA的细胞的Western blotting信号明显增强。120KDa蛋白与6A8 cDNA推测的编码蛋白质的分子量相当。这表明6A8 cDNA编码的蛋白质的确是一种α-甘露糖苷酶,可能属于Ⅱ类α-甘露糖苷酶。 鉴于用单抗筛选cDNA文库的反应有可能存在非特异性,亦即所用的单抗可能并非特异地识别6A8 α-甘露糖苷酶,为此我重新制备了特异的6A8单抗。用6A8 cDNA3’端1275bp核苷酸序列在原核表达载体中表达的蛋白质免疫小鼠制备了6A8单抗。单抗6A8对靶细胞3D5的反应能被6A8 cDNA 3’端1275bp核苷酸序列编码的蛋白质所吸收。用6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制的SKW6细胞作靶细胞用Western blotting检测了单抗6A8的特异性,观察到与6A8 α-甘露糖苷酶表达正常的对照细胞相比,6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制的细胞的信号强度明显降低。 用新制备的6A8单抗作探针,从两个角度证明了6A8 α-甘露糖苷酶也表达于胞膜:1)用6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制的活SKW6细胞作靶细胞行免疫荧光染色,与6A8 α
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R392

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【参考文献】
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