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《中国协和医科大学》 1998年
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绿脓杆菌外膜蛋白与耐药性关系及其基因的克隆与应用研究

程巧梅  
【摘要】:建立了简易可行的测定绿脓杆菌对药物外膜通透性的方法,在此基础上,对临床分离的耐β—内酰胺抗生素(至少耐一种β—内酰胺抗生素)的绿脓杆菌测定了对头孢唑啉及泰能的外膜通透性。通过对绿脓杆菌临床分离株的诱变,采用泰能浓度梯度平皿筛选与液体筛选相结合得到泰能耐药菌株715/R_1、715/R_2,对其测定了对泰能的外膜通透性,并对其膜蛋白进行了SDS-PAGE分析,表明其耐药性与外膜蛋白缺失引起的外膜通透率降低有一定相关性。进一步利用PCR技术克隆了该外膜蛋白基因,并在大肠杆菌中成功地得到表达;该基因可使泰能耐药菌株恢复敏感性。利用原株与诱变株为指示菌,建立了以绿脓杆菌外膜通透性为靶点的微生物来源的抗菌物质筛选方法。 根据单位菌体在一定时间内吸收抗生素的量,测定耐药菌株的外膜通透性。抗生素的定量测定采用杯碟法。首先制作所测抗生素的生物检定标准曲线,由抑菌圈直经可从标准曲线上计算出相应抗生素的量,以细菌细胞对抗生素的吸收率代表通透率。根据所建立方法我们对临床分离的101株绿脓杆菌测定了对头孢唑啉的外膜通透性;对其中32株测定了对泰能的外膜通透性;并利用对药物较为敏感的10株大肠杆菌和标准菌株检验了该方法的准确性。与此同时还测定了这些菌株对以上药物的最低抑菌浓度及产β—内酰胺酶的情况。 为进一步探讨绿脓杆菌耐药性与外膜通透性关系,通过对绿脓杆菌临床分离株715号采用紫外线与NTG固体平板诱变复合处理,采用泰能浓度梯度平皿筛选与液体筛选相结合得到泰能耐药株715/R_1、715/R_2、715/R_3(对泰能MIC分别为64、64、16μg/ml)连续传代多次其耐药性保持稳定;对715/R_1、715/R_2测定了对泰能的外膜通透性,由原泰能敏感菌株715号的100%分别降为36.54%与30.13%。膜蛋白SDS-PAGE分析结果表明:715/R_1、715/R_2与715号原株相比,明显缺少MW约45~49kD的一条带,该条带在715/R_3中仍存在,不过其含量要远远低于原株。经内、外膜蛋白分别进行SDS-PAGE检测,结果表明:715号原株经诱变后所得耐药菌株中缺失或减少的膜蛋白确实存在于外膜中,且该外膜蛋白在37℃保温10min后在该位置消失,表明该蛋白与泰能的渗入有关,提示该外膜蛋白为OprD_2。 以绿脓杆菌标准菌株PAO1总DNA为模板,通过PCR技术扩增了大
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:1998
【分类号】:R378

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【参考文献】
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