收藏本站
《中国协和医科大学》 2001年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体及其融合蛋白的研究

唐勇  
【摘要】:Ⅳ型胶原酶又称作明胶酶,根据分子量可分为72kDa和92kDa两种。两型酶都属于基质金属蛋白酶(MMPs)家族,其水解底物包括Ⅳ型、V型、Ⅶ型胶原等细胞外基质蛋白。Ⅳ型胶原是构成基底膜的关键组份,在基底膜中起支架作用。Ⅳ型胶原酶降解Ⅳ型胶原,破坏基底膜及细胞外基质的完整性,有助于肿瘤细胞的侵袭与转移。肿瘤细胞的侵袭能力与其分泌的Ⅳ型胶原酶活性密切相关。另外,新生血管内皮细胞也具有很高的Ⅳ型胶原酶活性。抑制Ⅳ型胶原酶等MMPs活性可以抑制肿瘤侵袭转移与抑制血管生成。 来源于小鼠的单克隆抗体3D6具有特异性结合Ⅳ型胶原酶的特性,并以其为基础构建导向药物获得了较好的疗效。为了获得更小型化的抗体片段,我们采用噬菌体呈现技术构建单链抗体(scFv)。从产生单抗的杂交瘤细胞中提取并纯化mRNA,运用RT-PCR分别扩增出抗体重链可变区(V_H)和抗体轻链可变区(V_L)基因。用重组PCR将二者以一段编码(Gly_4Ser)_3的连接DNA连接成为V_H-Linker-V_L形式的scFv基因。PCR扩增scFv片段,Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切后与经同样双酶切的载体pCANTAB5E连接得到重组质粒pCANscFv。转化大肠杆菌TG1,在辅助噬菌体M13KO7的援救下产生重组噬菌体抗体。经过免疫亲和筛选和ELISA检测,获得亲和力最高的一株阳性克隆43#。提取质粒pCANscFv-43,经Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,克隆入载体pET-30a(+)构建表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。表达产物主要以不溶性的包涵体形式存在,表达量占全菌蛋白的15%左右。将包涵体变性、复性后用ELISA测定其与Ⅳ型胶原酶的结合能力。单链抗体保持了亲本抗体特异性结合抗原的能力,但亲和力有所降低。单链抗体对高转移性人肺癌PG细胞分泌的Ⅳ型胶原酶有抑制作用。同时在体外能抑制肿瘤细胞的侵袭,抑制率与表达产物的剂量浓度相关,浓度1mg/ml的抑制率为68%。分别以V_H和V_L的一级序列为探针,在PDB数据库中搜寻与其同源性高的蛋白作为参考蛋白,利用MSI公司的Insight Ⅱ同源蛋白模建系统在SGI计算机图形工作站上模建V_H和V_L的三维空间结构后,搭建成抗Ⅳ型胶原酶单抗Fv片段的空间构象,并对模建蛋白进行分子力学和分子动力学优化。对优化后结构合理性的验证显示模建的三维结构是合理可信的。这为进一步改造scFv片段及研究其结构功能关系打下了基础。 大分子肽类抗肿瘤抗生素力达霉素(Lidamyein,LDM,又称C1027)具有细胞毒作用强、体内抗肿瘤活性高的特点,是单抗导向药物理想的“弹头”。力达霉素由辅基蛋白
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R73-3

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前8条
1 宋旭,包明敏,崔大鹏,王真,李电东;抗肿瘤抗生素C1027对人结肠癌HCT-8细胞凋亡相关基因表达的影响[J];药学学报;1999年10期
2 崔大鹏,王真,李电东;力达霉素对人结肠癌HCT-8细胞侵袭调节基因表达的影响[J];药学学报;2001年04期
3 邵荣光,甄永苏;新烯二炔类大分子抗肿瘤抗生素C1027的分子构成与活性关系[J];药学学报;1995年05期
4 周春水,徐琳娜,江敏,甄永苏;烯二炔抗癌抗生素单克隆抗体的制备及初步应用[J];药学学报;1997年01期
5 甄红英,薛玉川,甄永苏;抗肿瘤抗生素C1027抑制血管生成及其抗肿瘤转移作用[J];中华医学杂志;1997年09期
6 甄永苏,薛玉川,邵荣光;烯二炔类新抗生素C1027的抗肿瘤作用研究[J];中国抗生素杂志;1994年02期
7 甄永苏,邵荣光,江敏,李军智,王耐勤,董志伟;抗癌抗生素C1027与单克隆抗体偶联物的抗肿瘤作用[J];中国肿瘤生物治疗杂志;1995年02期
8 甄永苏;单克隆抗体药物治疗肿瘤的研究现状与展望[J];中国医学科学院学报;2000年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张洁;郑文永;王冬梅;;无选择标记转基因植物研究进展[J];安徽农业科学;2009年12期
2 唐昭军;肖纳新;;caveolin-1、P53及MMP-2在骨肉瘤中的表达及其意义[J];安徽医药;2009年09期
3 唐勇,甄永苏;抗Ⅳ型胶原酶单链抗体的表达及其对肿瘤细胞侵袭的抑制作用[J];癌症;2001年08期
4 何琪杨,姜兵,李电东,甄永苏;力达霉素对人肝癌bel-7402细胞凋亡基因表达和细胞骨架的影响[J];癌症;2002年04期
5 刘秀均,戴垚,商悦,李毅,甄永苏;力达霉素对小鼠结肠癌生长及其肝转移的抑制作用[J];癌症;2005年06期
6 王军,相丽,阎丽平,付海波,罗兵;基质金属蛋白酶组织抑制物-1 mRNA在胃癌组织中的表达[J];青岛大学医学院学报;2003年01期
7 郭玉芳;梅红;张丽红;刘巍;郑贤红;李一雷;;人乳腺癌组织活化型MMP-2的分布及意义[J];吉林大学学报(医学版);2006年01期
8 杨莉莉;贺巾超;董文;范伟全;凡炼炼;潘秦;牟旭鹏;颜炜群;;白蛋白信号肽引导天然N-端的rBPTI在毕赤酵母中高效分泌表达[J];吉林大学学报(医学版);2007年01期
9 李耀军,高萍,柳惠图,张伟;力达霉素对人红白血病K562细胞死亡的影响[J];北京师范大学学报(自然科学版);2005年04期
10 ;Cancer Immunotherapy of Targeting Angiogenesis[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年03期
中国重要会议论文全文数据库 前6条
1 曾林;孙岩松;杨晓;王冬平;胡仲明;曹永成;丁吉元;;p21~(HBsAg/HBsAg)转基因小鼠肝癌MMP-2蛋白的表达及意义[A];中国实验动物学会第七届学术年会论文集[C];2006年
2 梁雄利;李子孝;陈宝师;刘福生;江涛;;人脑胶质瘤中MMP-9表达与纤维束损害的相关性[A];中国水利电力医学科学技术学会临床医学专业委员会外科专业、护理专业2007年会论文汇编[C];2007年
3 喻明霞;牛麟;王晶;尹丙娇;姜小丹;冯玮;李卓娅;;TM-TNF-α单克隆抗体体内外抗肿瘤活性的研究[A];2008年中国病理生理学会第十一届肿瘤和第十二届免疫专业委员会学术会议论文集[C];2008年
4 魏于全;姜愚;;抗体治疗在肿瘤研究和治疗中的进展[A];中国临床肿瘤学教育专辑(2002)——中国抗癌协会第六届临床肿瘤协作中心(CSCO)学术年会论文集[C];2002年
5 李荀;李亚林;尹文刚;徐文方;;以Ⅳ型胶原酶MMP为靶点的抗癌药物研究[A];第三届中国肿瘤学术大会教育论文集[C];2004年
6 刘友章;弓淑珍;黄晓燕;;胃炎Ⅰ号对大鼠胃癌前病变组织MMP-7mRNA、MMP-9AmRNA表达的影响[A];2009年中华中医药学会内科分会全国中医内科临床科学研究专题研讨会论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王巍;Nup107和claudin23在转移性胰腺癌中的作用及分子机制的初步研究[D];中国医科大学;2010年
2 蔡维嘉;利用毕赤酵母系统的丙型肝炎病毒重组E1E2糖蛋白的表达、纯化和性质研究[D];武汉大学;2010年
3 费晨;基质金属蛋白酶在痘病毒感染中的作用和表达变化[D];西北农林科技大学;2010年
4 罗清;人核诱导凋亡因子1(NAIF1)基因在胃癌及乳腺癌中的差异表达及功能研究[D];北京协和医学院;2011年
5 成毅明;精子发生相关蛋白LM23的研究[D];北京协和医学院;2009年
6 孙凡;水稻OsPDCD5基因的功能研究和应用及油菜csRRM2结构域在棉花中的功能鉴定[D];复旦大学;2011年
7 孙延龙;基于活性的化学小分子探针的设计与合成及其抗肿瘤活性研究[D];中国海洋大学;2011年
8 杨冬;代谢工程改造的链霉菌生物合成去甲基C-1027和iso-Migrastatin的研究[D];浙江大学;2010年
9 刘明;大豆子房原位转化法的建立与应用[D];大连理工大学;2011年
10 李梢;类风湿性关节炎从“络”辨治及寒热方剂作用机理研究[D];北京中医药大学;2001年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李永梅;子宫内膜异位症患者在位内膜中LN及uPAR的检测及其意义[D];郑州大学;2010年
2 刘晓锦;p73、MMP-7及PTEN在人口腔扁平苔藓及口腔鳞状细胞癌中的表达及意义[D];郑州大学;2010年
3 郭振营;胃癌中Claudin-1、MMP-2的表达及其意义[D];郑州大学;2010年
4 陈妍琼;KiSS-1、MMP-2和MVD在不同食管病变组织中的表达及其相关性研究[D];郑州大学;2010年
5 刘力峰;饮酒对高脂饮食家兔颈动脉粥样硬化形成的实验研究[D];泰山医学院;2005年
6 杨杰;TRAIL与LDM联用和作用机制及TRAIL蛋白的表达[D];北京协和医学院;2010年
7 谢小娟;放射性豚鼠咽鼓管损伤的初步研究[D];广西医科大学;2011年
8 王旭峰;RECK和MMP-9在喉鳞癌中的表达及相关性研究[D];山西医科大学;2011年
9 史志勇;葡萄籽原花青素抗人胰腺癌细胞的实验研究[D];山西医科大学;2011年
10 梁水美;小麦胚乳特异性多酚氧化酶基因RNA干扰载体的构建及遗传转化[D];山东农业大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 许永杰,李电东,甄永苏;具有强烈杀伤肿瘤细胞活性的新抗肿瘤抗生素C1027分子作用机制[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1992年08期
2 邵荣光,甄永苏;单克隆抗体与抗癌抗生素C1 027组建偶联物及强化偶联物对肝癌细胞的活性[J];细胞与分子免疫学杂志;1991年03期
3 甄永苏,邵荣光,周锡漳,王耐勤,刘彤,周思群,董志伟;抗癌抗生素C_(1027)与单克隆抗体偶联物抗胃癌作用的实验研究[J];细胞与分子免疫学杂志;1993年03期
4 邵荣光,甄永苏;新抗癌抗生素C1027及其单克隆抗体组装偶联物的抗肿瘤活性[J];药学学报;1992年07期
5 李军智,江敏,薛玉川,甄永苏;抗癌抗生素C1027与单克隆抗体Fab片段偶联物的抗肝癌作用[J];药学学报;1993年04期
6 王维刚,甄永苏;以抗体为基础的肿瘤靶向治疗和基因治疗[J];药学学报;1999年10期
7 甄永苏;抗肿瘤导向药物研究的现状与展望[J];药学学报;1994年01期
8 王维刚,徐琳娜,张胜华,薛玉川,甄永苏;单克隆抗体与平阳霉素偶联物对肿瘤的区域性导向实验治疗[J];药学学报;1997年09期
9 甄红英,薛玉川,甄永苏;抗肿瘤抗生素C1027抑制血管生成及其抗肿瘤转移作用[J];中华医学杂志;1997年09期
10 甄永苏,薛玉川,邵荣光;烯二炔类新抗生素C1027的抗肿瘤作用研究[J];中国抗生素杂志;1994年02期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 鞠辉明;王霞;周元国;刘宗平;陈星云;;大鼠RGS4基因的克隆及在原核中的表达[J];第三军医大学学报;2007年23期
2 雷祖宝;操乐杰;李润生;李先武;;hnRNP A2/B1基因的蛋白表达初步探讨[J];中国肿瘤临床;2006年15期
3 刘志锋,邵紫韫,徐佳,刘靖华,邓鹏,姜勇;His标记的小鼠线粒体转录因子A的克隆和表达纯化及其多克隆抗体的制备[J];第一军医大学学报;2005年07期
4 姚智燕;赵瑞景;朱铁年;尹晓琳;冯惠东;王秀荣;马翠卿;;人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达[J];中国免疫学杂志;2006年01期
5 卢晓;蒋小滔;朱平;富宁;;重组人血红蛋白δ链的制备与鉴定[J];热带医学杂志;2009年01期
6 何金桃;金亚美;刘金明;蔡幼民;岳城;;噬菌体展示技术及其在寄生虫研究中的应用[J];生物技术通报;2009年S1期
7 宿文辉;张杰;张丽雁;宗志红;张哲;于秉治;;人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化[J];细胞与分子免疫学杂志;2006年05期
8 曹玉红;张光运;张国成;;人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定[J];细胞与分子免疫学杂志;2008年02期
9 云雪霞;胡静;陈清;;霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达[J];中国人兽共患病学报;2007年02期
10 黄明;韦剑;周飞燕;;人源胸腺素α原和白介素2融合蛋白的基因克隆与原核表达[J];广东药学院学报;2008年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 施碧红;温建新;吴伟斌;施巧琴;吴松刚;;Bacillus subtilis FS321淀粉酶基因的克隆与表达[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
2 徐亚男;赵庆顺;徐永华;;转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白的基因克隆、表达和活性研究 Ⅱ.TGF α-PE40高效表达重组质粒[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年
3 徐静;李文俊;杨宏亮;郑林;胡宝瑜;傅爱芬;赵伶兹;郭晓奎;姜叙诚;;问号钩端螺旋体胶原酶在钩体病豚鼠模型的肺组织中的表达[A];中华医学会病理学分会2007年学术年会暨第九届全国病理大会论文汇编[C];2007年
4 盛唯瑾;苗庆芳;商悦;甄永苏;;抗EGFR单链抗体与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性研究[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年
5 崔向丽;赵志刚;苗庆芳;张胜华;甄永苏;;抗HER2单链抗体与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性研究[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年
6 张兴群;王梁华;焦炳华;缪辉南;袁勤生;;高密度发酵制备重组人OCIF活性域多肽融合蛋白[A];中国海洋生化学术会议论文荟萃集[C];2005年
7 江涛;周艳琴;刘琴;聂浩;姚宝安;赵俊龙;;弓形虫微线体蛋白MIC3基因的克隆及原核表达[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集[C];2006年
8 江涛;周艳琴;刘琴;聂浩;姚宝安;赵俊龙;;弓形虫ROP2基因的克隆及原核表达[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集[C];2006年
9 刘金生;王郡甫;张捷;田志刚;;内抑素融合蛋白的发酵与纯化研究[A];山东免疫学会、山东微生物学会医学微生物学专业委员会、山东省医学会微生物学和免疫学专业委员会、山东省医药生物技术学会2001年学术年会论文汇编[C];2001年
10 郑艳波;甄永苏;;CD13靶向肽与力达霉素强化融合蛋白的制备及其抗肿瘤活性[A];2007医学前沿论坛暨第十届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 陈雪频;亲和力决定影响力 欧美企业领舞2005[N];第一财经日报;2006年
2 本报记者 刘冬;塑造有亲和力的酒店[N];中国商报;2000年
3 崔彦玲;以高度提高影响力 以贴近增强亲和力 以创新提升竞争力[N];常州日报;2006年
4 山系省壶关县明德小学教师 盖志清;健康的心态是提高教学质量的关键[N];中华新闻报;2007年
5 张利红;新写实小说的亲和力[N];文艺报;2008年
6 记者 周祚林洪浩 罗桦琳 通讯员 穗创建;用微笑提升广州亲和力[N];广州日报;2008年
7 邓妍;谭信乐的古钟情结[N];财经时报;2006年
8 新华社;亲和力比业务能力更重要?[N];新华每日电讯;2007年
9 段万义;做个有亲和力的导游[N];中国旅游报;2008年
10 记者 陈敏;虎林社区党建充分体现亲和力[N];鸡西日报;2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 唐勇;抗Ⅳ型胶原酶单链抗体及其融合蛋白的研究[D];中国协和医科大学;2001年
2 王昕;巨噬细胞集落刺激因子可溶性受体的克隆表达及其相关性研究[D];中国协和医科大学;1998年
3 邓尚龙;石斑鱼抗菌肽Hepcidin基因的克隆、表达与抗菌活性研究[D];吉林农业大学;2008年
4 郭雨刚;毕赤酵母表达系统及其应用[D];中国科学技术大学;2012年
5 苗庆芳;抗Ⅳ型胶原酶单域抗体与力达霉素构建的基因工程强化融合蛋白及其抗肿瘤活性研究[D];中国协和医科大学;2004年
6 郭虹;弓形虫侵入相关分子ROP1基因的克隆及其DNA免疫研究[D];中山医科大学;1999年
7 彭玲;抗骨桥蛋白单链抗体可抑制乳腺癌转移和血管生成[D];第二军医大学;2007年
8 钟根深;以明胶酶为靶点的小型化抗体与力达霉素构建的基因工程强化融合蛋白及其抗肿瘤活性的研究[D];中国协和医科大学;2010年
9 柏亚铎;犬瘟热病毒、犬冠状病毒入侵宿主细胞机制研究[D];中国农业大学;2005年
10 刘红岩;白细胞介素-6基因的克隆、表达及中试生产工艺的初探[D];中国协和医科大学;1998年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 柳辉;枯草杆菌α-淀粉酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达[D];华中科技大学;2007年
2 刘占通;猪α干扰素基因克隆、原核表达及抗病毒活性研究[D];河南农业大学;2005年
3 章建楠;嵌合HEV表位的HBcAg颗粒在毕赤酵母中的分泌表达[D];厦门大学;2008年
4 林丽彬;大鼠内皮抑素基因克隆及其在大肠杆菌中的表达[D];福建医科大学;2007年
5 孟文丽;江浙短尾蝮蛇纤溶酶原激活剂的原核表达、纯化及其鉴定[D];福建医科大学;2008年
6 房永祥;猪Toll样受体2基因的克隆及稳定表达细胞系的建立[D];甘肃农业大学;2007年
7 王辉;斑马鱼多聚免疫球蛋白受体(zplgR)基因的克隆[D];山东师范大学;2007年
8 黄亮;黑曲霉A9葡萄糖氧化酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达[D];河北农业大学;2007年
9 彭丽婵;兔IFRG基因的克隆及表达分析[D];安徽大学;2010年
10 仲伟麒;里氏木霉木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中高效表达的研究[D];东北农业大学;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026