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《中国协和医科大学》 1996年
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大鼠单克隆抗体的制备、鉴定、基因克隆、抗原分析以及药物偶联物的抗肿瘤作用研究

江敏  
【摘要】:大鼠抗体具有一些小鼠抗体不具备的特点,抗体分子的轻链95%为κ型。因此可以利用小鼠抗大鼠抗体Igκ-1a抗体,高度特异性地将接种于Igκ-1b大鼠体内的具有Igκ-1a等位基因杂交瘤抗体分离纯化出来。通常认为大鼠杂交瘤单克隆抗体难以制备获取。本研究用人免疫球蛋白IgG、IgM和辣根过氧物酶免疫LOU/C大鼠,并与大鼠IR983F细胞融合,获得数株抗人IgG、IgM和辣根过氧化物酶的单克隆抗体,融合率在70%以上,杂交瘤能在培养条件下长期生长并稳定地分泌抗体,动物体内接种能产生含有较高浓度抗体的腹水,抗体的提取方法简便、有效,ELISA测定显示数株单克隆抗体均有较高的亲和力,亲和常数为10~7-10~(10)M~(-1),因此用大鼠杂交瘤技术制备高亲和力的单克隆抗体是可行的,有利于抗体的大量制备。 以人肝癌BEL-7402细胞作为靶抗原免疫LOU/C大鼠,取其脾细胞与大鼠IR983F骨髓瘤细胞融合,获得稳定分泌抗人肝癌单克隆抗体3A5杂交瘤细胞株。ELISA交叉反应检测3A5对人肝癌BEL-7402、7721和Q3细胞皆呈强阳性,对人口腔鳞癌KB细胞、人胚肺2BS细胞和小鼠正常肝细胞等呈阴性。免疫组织化学检测单抗3A5对人体各正常器官组织的交叉反应显示,此抗体对人正常心、肝、脾、肺、淋巴结,中枢神经系统、肾小球、甲状腺、血液细胞等均无反应,对肾小管上皮细胞显示弱阳性,而对临床肝癌、肠癌的病理切片则显极强的阳性反应。单克隆抗体经免疫亲和层析分离后,SDS-PAGE凝胶电泳显示抗体的纯度达95%以上,符合单克隆抗体临床应用的标准。免疫电镜研究显示,单抗3A5对靶细胞特异性结合与内化,肝癌细胞内单抗3A5胶体金颗粒簇数为0.89,KB细胞为0.22,相差4倍。肝癌细胞对胶体金颗粒的内化能被预先加入的单抗3A5特异性地封闭。将单抗3A5与平阳霉素进行偶联,用克隆生成法观察偶联物和游离平阳霉素对肿瘤细胞的杀伤作用,按IC50比较,偶联物对靶细胞肝癌细胞的杀伤作用(IC50=7.5×10~(-9)M)比对非靶细胞KB细胞的作用(IC50=7×10~(-7)M)约强100倍。偶联物对靶细胞的作用比游离平阳霉素(IC50=3×10~(-7)M)约强50倍。 单抗3A5用木瓜蛋白酶消化制备得单抗的Fab片段,抗体片段的反应活性略
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:1996
【分类号】:R730.5

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【参考文献】
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