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《中国协和医科大学》 1992年
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人G-CSF cDNA的克隆和鉴定及其在哺乳类细胞中的稳定表达

李飞宇  
【摘要】:粒细胞集落刺激因子(简称G-CSF)是集落刺激因子(CSF_8)家族的重要因子。具有选择性刺激定向千细胞分化生成中性粒细胞集落的功能,并且对某些白血病细胞的分化和增殖有影响。现已被广泛用于基础和临床研究。我们应用多聚酶链反应(PCR)等技术快速扩增并克隆了G-CSF cDNA,进行了序列分析,构建了其逆转录病毒重组表达载体并在小鼠骨髓瘤细胞中成功地表达了具有生物活性的G-CSF。为进一步研究造血细胞分化机制、白血病发病机制及临床应用打下基础。 人膀胱癌细胞系(5837)经常规培养至所需数量后,用异硫氰酸胍/氯化铯法提取总RNA,应用CETUS的GeneAmp RNA PCR Kit系统进行逆转录反应合成cDNA第一条链,用DNA合成仪合成G-CSF cDNA的上游和下游特异性引物,以cDNA第一条链为模板进行PCR反应,特异性扩增G-CSF cDNA。凝胶电泳显示,放大的cDNA片段为640bp左右。从电泳胶回收后,用KpnⅠ和hindⅢ酶切,将酶切片段克隆入噬菌体M13mp18中,用USB DNA序列分析系统进行序列分析。将插入M13mp18的G-CSF cDNA片段用同法克隆到M13mp19中进行反方向的序列分析。结果显示:所克隆的G-CSF cDNA全编码区序列为612bp,它编码30个氨基酸的信号肽和174个氨基酸的成熟蛋白。除第43位codon出现一个碱基突变(CAC→TAC)导至一个氨基酸改变(组氨酸→酪氨酸)外其余部分与Souza等198(?)年的结果一致。用KpnⅠ和HindⅢ酶切并分离M13mp19中的G-CSF片段,经用T4polymerase处理产生G-CSF cDNA片段的(?)'平端,与XM-6逆转录病毒载体(经BglⅡ、Mung bean nuclease和HindⅢ处理)重组。将重组载体在E.coli中扩增,常规提取。Southern杂交及酶切图谱显示:G-CSF cDNA片段已插入载体中,其插入的位置及方向均与设计的一致。利用Lipofectin方法将重组逆转录病毒载体转入包装细胞PA317中,在G418筛选下挑选产生高滴度amphotropic重组病毒的PA317克隆,以其上清在体外感染SP2/0细胞,经G418筛选,用有限稀释法单克隆化,体外软琼脂集落培养(CFU-GM)检测显示:转化的SP2/0细胞培养上清具有G-CSF生物活性,能有效地刺激小鼠骨髓造血干细胞增殖和分化形成中性粒细胞集落。 本研究应用PCR等方法快速有效地扩增和克隆了G-CSF cDNA,经用其重组逆转录
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:1992
【分类号】:R392

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