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受体介导的肝细胞特异性单纯疱疹病毒胸苷激酶基因转移体内外研究

阎波  
【摘要】:基因治疗的成功有赖于安全有效的基因转移方法和高水平表达的外源基因。理想的基因转移载体应具有安全性高,组织细胞特异性基因转移和直接体内应用等特点。在目前应用的基因转移载体中,病毒性载体发展比较完善,但由于缺乏靶向性并仍有一定的危险性,因而其应用范围受到限制。非病毒性载体由于相对安全。尤其是受体介导的基因转移方法具有组织细胞特异性,故近来在基因转移研究中渐受重视。研究表明,在受体介导的基因转移过程中,同时应用复制缺陷性腺病毒,或将其修饰后直接用于合成分子偶联载体,可提高基因转移效率达100%。然而,由于在不同组织细胞膜存在腺病毒受体,分子偶联载体可能通过腺病毒受体进入细胞内,致使基因转移靶向性受到影响。为解决这一问题,我们考虑在构建分子偶联载体中的重组质粒表达载体时,应用组织细胞特异性调控序列,以期在转录水平进一步限制外源基因的表达于靶细胞中,从而保证受体介导基因转移的靶向性,同时可望导致外源基因的高效表达。 在本研究中,我们应用腺病毒增强的、去唾液酸糖蛋白(ASOR)受体介导的基因转移方法进行体内外肝细胞特异性基因转移研究。在真核表达质粒载体构建中,将外源基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因置于人白蛋白(ALB)基因启动子/增强子或巨细胞病毒(CMV)启动子控制之下,HSV-TK可特异导致核苷类似物-ganciclovir(GCV)等磷酸化,与正常核苷酸竞争而抑制细胞DNA的合成,导致细胞的死亡,故也称自杀基因。在合成分子偶联载体后,进行透射电镜分析或直接转染肝脏肿瘤细胞系HepG2细胞(ASOR受体阳性)和非小细胞肺癌细胞系A549细胞(ASOR受体阴性),从不同水平检测HSV-TK基因的表达,并比较两种启动子对基因表达的影响;根据体外研究结果,选用高水平表达的重组质粒载体


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