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《中国协和医科大学》 1988年
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大鼠有核红细胞(中幼、晚幼成红细胞)与小鼠浆细胞瘤(SP2/0)细胞杂交调控恶性表型及基因表达的研究

张庆一  
【摘要】:本研究选用正常大鼠中幼、晚幼成红细胞与小鼠浆细胞瘤(SP2/0)细胞进行异种细胞杂交,研究哺乳动物红细胞胞质因子对肿瘤细胞恶性调控的效应及其机制。 一、通过哺乳动物成体骨髓及造血期胚肝的红系细胞终末分化过程的形态学观察,验证了正常情况下哺乳动物体内红系细胞发育到晚幼成红细胞阶段出现排核现象。用改良的Iscove甲基纤维素方法对动物骨髓红系祖细胞进行体外培养,对形成的红系集落细胞分化进行的形态学观察发现:(1)在低浓度红细胞生成素(Erythropoletin,简称EPO,下同)培养条件下,处于较晚发育期的红系祖细胞CFU-E可形成数十个细胞组成的集落;但集落之间,其细胞数量及发育的同步性有较大差异;(2)在高浓度EPO培养条件下,处于较早发育期的红系祖细胞BFU-E可形成数千个甚至上万个细胞组成的大集落,而且生长同步性较高;(3)在CFU-E及BFU-E的培养集落中均可观察到自然出现的核固缩及排核现象。上述体内、体外晚幼成红细胞排核现象,为红细胞自然排核学说以及薛杜普等提出的红系终末细胞中存在不利于细胞核增殖生长的“胞质因子”工作假说提出了有利的佐证。 二、利用Harrison分离骨髓血细胞方法,用40%至70%不连续Percoll介质梯度,从15天Wistar大鼠胚肝中分离中幼、晚幼成红细胞。从70%Percoll梯度介面,比重为1.095g/ml可收集到纯度高达96%的中幼、晚幼成红细胞。经(Giemsa-Wright血细胞染色,联苯胺染色以及透射电镜检查鉴定,除极少量早幼成红细胞和网织红细胞外,几乎没有其他类型细胞杂混。台盼兰活体染色检查表明:分离后的中幼、晚幼成红细胞保持95%以上的活性率。本方法操作简便,需时间少,分离后的细胞纯度及活性率都较高,可直接用作细胞生物学、生化等研究。 三、利用细胞杂交的细胞工程手段,首次系统地研究了大鼠中幼、晚幼成红细胞与小鼠浆细胞瘤(SP2/0)细胞融合后恶性表型的表达状态,分析自然去核前红细胞胞质对骨髓瘤细胞恶性增殖的调控作用,以及晚幼期固缩核重新被激活的可能性。实验结果表明:(1)杂交细胞出现瘤细胞与网织红细胞杂交同样的表型逆转及去恶性化特征,主要表现在细胞体积增大、核质比例减小;DNA合同速率降低、分裂指数下降,细胞生长显著减慢;在软琼脂中不形成集落,在裸鼠体内失去了长瘤能力。超微结构分析表明,杂交细胞表面膜微绒毛、指状突及皱褶突等均明显减少,核内异染色质比例增高,核仁数目减少或消失,细胞质中常可见有空泡或黑色致密颗粒出现;少数杂交细胞出现线粒体肿胀、核固缩甚至排核现象。(2)细胞组化染色及蛋白电泳分析显示;杂交细胞的细胞骨架和表面膜蛋白发生了“正常化”的改变,表现为微管呈规律性排列,萤光增强;细胞膜纤粘蛋白(flbronectin,简称FN)在数量上明显增多;出现大鼠、小鼠两种类型的乳酸脱氢酶亚基电泳条带;出现大鼠和小鼠两种类型珠蛋白基因产物血红蛋白的电泳条带。大鼠基因产物的出现表明大鼠晚幼期固缩核于杂交后可被重新激活而表达;小鼠珠蛋白基因产物血红蛋白的出现则表明大鼠中幼、晚幼成红细胞胞质中可能存在激活异种细胞珠蛋白基因表达的调节物质,使原来并不活动的非红系细胞基因组中的珠蛋白开启表达。上述结果验证了我们有关哺乳类红细胞中存在调节恶性分裂物质的论点,并证明了这种物质在排核前的中幼、晚幼成红细胞中早已出现。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:1988
【分类号】:R730.2

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【参考文献】
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