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ODC反义RNA真核表达质粒的构建及人肺鳞癌细胞恶性表型的逆转

关钧  
【摘要】:鸟氨酸脱羧酶(ODC,EC4,1.1.17)是多胺生物合成途径中的限速酶。多胺包括腐胺(Pu)、精脒(Spd)及精胺(Sp),在真核细胞增殖与分化过程中起着重要的调节作用。ODC表达的失控及继之引起的多胺堆积与肿瘤的发生、发展密切相关。在一些癌基因的转化细胞系和几乎所有的动物肿瘤中均有ODC基因产物的异常升高。我们研究组已有的工作及目前的文献资料均证明ODC特异抑制剂二氟甲基鸟氨酸(DFMO)可以抑制肿瘤细胞增殖并诱导其分化。提示控制多胺合成可能是一条有效的抗癌途径。为了从基因水平控制多胺的生物合成及进一步研究ODC基因在维持肿瘤恶性表型中的作用。我们采用反义RNA技术,首次构建了ODC反义RNA真核表达质粒,并对被其转染的人肺鳞癌细胞在生长特性、致瘤性方面的改变及其分子机理进行了较系统的研究。其主要内容简述如下: (一) 表达质粒的构建:用HindⅢ酶解pODC10/2H质粒,分离得到1768bp大小,含人ODC cDNA及29bp pBR322载体序列的限制性片段,并将其按正义或反义两种方向随机插入pRc/CMV载体HindⅢ单一酶切位点。该载体含用于基因表达的巨细胞病毒启动子和可用G418选择的新霉素抗性基因。经过一系列转化、筛选及酶切分析,我们同时获得正义和反义两类表达质粒,分别命名为pCMV/ODCs和pCMV/ODCas。 (二) pCMV/ODCas质粒对人肺鳞癌L78细胞的转染:用磷酸钙沉淀法将pCMV/ODCas质粒导入人肺鳞癌L78细胞,经G418选择,获4株G418抗性细胞克隆,称之为L78/ODCasl—L78/ODCas4。其中L78/ODCasl和L78/ODCas4呈明显的接触抑制和血清依赖性生长,故选这两株细胞作以下进一步的分析和研究。 (三) 外源ODC反义序列在转染细胞基因组中的整合:(1)用HindⅢ酶解细胞基因组DNA,经Southern blot分析,发现转染细胞比L78 亲


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