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《中国协和医科大学》 2001年
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抗CD_3基因工程嵌合抗体的研究

徐晨  
【摘要】:本论文采用构建重组噬菌体抗体库和噬菌体表面显示技术,从HIT3a杂交瘤细胞中,克隆抗CD_3抗体轻、重链可变区基因,构建抗CD_3人-鼠嵌合抗体片段Fab'和嵌合全抗IgG的表达载体,分别在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行表达,并对其体外生物活性进行初步研究;又在计算机图形工作站上同源模建了Fab'的三维空间结构,为今后进行人源化改建、抗体模拟等工作打下初步基础。 1 克隆抗CD_3单抗可变区基因和构建噬菌体显示抗体库 采用“一步法”常规提取HIT3a杂交瘤细胞总RNA,用Oligo(dT)_(12)为引物逆转录成cDNA,再用重组噬菌体抗体显示系统分别克隆抗CD_3单抗轻、重链可变区基因,利用(G_4S)_3连接肽基因经over-lap PCR拼接成scFv基因,重组到pCANTAB5E载体的酶切位点上,构建成抗CD_3单链抗体噬菌体显示文库,库容量大小约3x10~6。以CD3~+表型的Jurkat细胞为靶细胞,对抗CD_3重组噬菌体抗体库进行5轮免疫筛选(panning),获得多个具有CD_3抗原结合活性的克隆。PCR扩增scFv基因和对PCR产物BstNI酶切指纹图谱分析结果表明,经过5轮panning后获得的噬菌体抗体库基本均一。挑选三个显色较强的克隆进行基因测序分析,显示这三个克隆的基因序列完全一致,均完全符合PDB文库中抗体基本框架序列,是抗体基因序列。 2 构建、表达抗CD_3嵌合抗体Fab'(?)段和测定体外生物活性 利用PCR从抗CD_3单链抗体表达载体pCANTAB 5Ecd3scFv扩增抗CD_3抗体轻、重链可变区基因,分别以MluI+StyI、MluI+ApaI消化后,重组到分别带有人免疫球蛋白C_L区和CH_1区的sspB11、sspB12载体相应的内切酶位点中,构建成中间载体pBYZLC_3和pBYZHC_3;再分别以MluI+NheI、SpeI+SphI消化中间载体质粒DNA,将V_L+CL和V_H+CH1
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R392

【参考文献】
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