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《中国协和医科大学》 2000年
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轮状病毒VP7基因修饰、表达及免疫原性研究

刘勇  
【摘要】:轮状病毒(Rotavirus,RV)是婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体,每年引起全世界约87万婴幼儿死亡。轮状病毒主要中和抗原VP7对发展基因工程疫苗具有重要意义。本文就如何提高VP7基因的免疫原性进行了一些探索。 首先,通过改造基因3’端,删除VP7成熟蛋白C端的1/3,利用pGEX-KG原核表达载体在大肠杆菌BL-21中实现了稳定高效表达,表达产物占菌体总蛋白的30%左右,利用Glutathione Sepharose 4B谷胱甘肽亲和纯化系统对表达产物进行分离纯化。Western Blot实验表明,表达产物可被抗轮状病毒SA11的抗体特异识别并结合。将纯化的重组抗原免疫家兔或小鼠,诱导机体产生了抗SA11病毒的中和抗体,证明原核系统表达的SA11 VP7重组蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。 然后,为提高VP7基因的免疫原性,对VP7基因进行修饰。用流感病毒血凝素(influenza virus hemagglutinin)信号肽替换VP7野生型信号肽,促使VP7分泌表达;通过在分泌型VP7基因下游融合流感病毒血凝素膜锚和胞质结构域编码序列,构建了表达后可锚定于宿主细胞膜表面的VP7基因。将修饰前后的VP7基因在Hela细胞中进行表达检测,免疫荧光实验证明,VP7分泌和跨膜基因修饰达到了预期效果。把野生型、分泌型和膜锚定型VP7基因分别插入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3的CMV启动子下游,构建DNA疫苗。用携带三种不同形式VP7基因的DNA疫苗分别免疫小鼠,比较其免疫原性。在此基础上,用VP7 DNA疫苗和大肠杆菌表达的VP7抗原联合免疫小鼠,探讨重组抗原蛋白对VP7 DNA疫苗免疫原性的影响。三种VP7基因DNA免疫以及和重组VP7抗原蛋白的联合免疫均在小鼠体内诱导产生了SA11中和抗体。无论有否蛋白抗原同时使用,VP7基因分泌或跨膜修饰都未能显著增强其
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:R373

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