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《中国协和医科大学》 2000年
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微载体制备甲肝灭活疫苗的研究

井申荣  
【摘要】:甲肝灭活疫苗具有良好的免疫原性、安全性和效力,诱导人体产生的中和抗体可以维持20年以上,具有广阔的应用价值和市场前景。但制备甲肝病毒的传统生产工艺难以满足对病毒抗原的需求,为此,我们对应用可自动化大规模生产的微载体培养技术制备甲肝病毒灭活疫苗的工艺进行了初步探索。 本文工作包括4个部分:①HAV的分离、适应和鉴定;②微载体技术制备HAV;③试制HAV灭活疫苗及检测其免疫原性;④分离株的基因型检测和适应机理的初步探讨。 微载体培养技术的良好细胞基质是Vero细胞,所以首先将甲肝病毒适应到Vero细胞中。应用恒河猴胚肾(MEK)细胞从临床标本中分离和适应甲肝病毒,作为适应于Vero细胞的过渡步骤。分离的野毒株经过阻断实验、中和实验、免疫荧光和免疫电镜观察、核酸鉴定证明是HAV。 HAV的MEK细胞分离株W、X及KMB17细胞分离株Ch6在MEK细胞传代过程中抗原滴度不断地提高,毒株Ch6 P9 28天、W P7 21天、X P7 28天增殖达到最高峰,ELISA测定其抗原滴度分别为1:1024、1:512、1:1024,感染滴度(logTCID_(50)/ml)分别为8.33、8.17、8.50。这三株病毒用MEK细胞培养时都有一过性分泌到细胞外的现象。 MEK细胞适应株W、X和Ch6的第4代向Vero细胞适应,只有Ch6和W株经盲传后适应到Vero细胞上,并且随培养代次的增加,病毒滴度不断提高。毒株Ch6和W的第6代产毒峰都是21天,抗原滴度皆为1:256,感染滴度分别为8.17、8.00。W株在Vero细胞中传至12代,抗原滴度可达到1:1024;从10代起进行带毒传代,连续传6代后,第10天抗原滴度基本稳定在1:1024。培养过程未见细胞病变和病毒分泌到胞外的现象。 应用磁力搅拌器和搅拌瓶进行微载体培养Vero细胞和MEK细胞制备甲肝病毒。Cytodex-1使用浓度3mg/ml,Vero细胞在Cytodex-1上培养7~9天长成单层(8.0×10~5cells/ml),细胞数量增加了5~10倍,500ml微载体培养的Vero细胞总量相当于20个罗氏瓶(2×10~7cells/瓶(200cm~2)),即20升体积;MEK细胞需要7~9天长成单层(5.5×10~5cells/ml),增长了4~5倍,500ml微载体培养的MEK细胞总量相当于27个罗氏瓶(1×10~7cells/瓶(200cm~2)),即27升体积。在生长阶段,Vero细胞每10~5个每日消耗葡萄糖为0.120±0.022mg,每日积累的乳酸量为0.065±0.020mg,MEK细胞10~5个每天消耗葡萄糖为0.150±0.059mg,产生的乳酸为0.091±0.026mg。 微载体培养的Vero细胞和MEK细胞长成单层后分别接种HAV W株和X株,维持培养28天后收毒,ELISA检测其抗原滴度分别为1:128、1:256,感染滴度
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:R392

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