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《中国协和医科大学》 2000年
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胰岛素调控大鼠肝癌细胞系报告基因表达的研究

冯凯  
【摘要】:糖尿病造成的主要临床问题是长期高血糖对机体的伤害,良好的血糖控制可以明显减少糖尿病并发症的发生率。而糖尿病急慢性并发症是糖尿病患者致死或致残的主要原因。治疗糖尿病要达到的最终目的,是在日常变化的膳食条件下,把血糖稳定在相对狭小的生理范围内。但每天通过皮下多次注射胰岛素的方法来强化血糖的控制,常常会增加低血糖的发生率,因此它不是最理想的治疗方案。糖尿病的基因治疗己成为目前最具前景的治疗策略,它是通过基因转移技术对细胞进行基因改造,恢复胰岛素生理性分泌,改善糖尿病患者临床状态的治疗方法。通过基因修饰非β细胞,使其替代体内功能不足的胰岛细胞表达分泌胰岛素,是糖尿病基因治疗的一种策略,它的主要优点是加工的非胰岛细胞不会受到机体针对胰岛细胞的自身免疫伤害。但寻找理想的调控基因是这一研究的难点。为了研究磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)启动子片段在肝细胞内的转录调节作用,本课题主要进行了以下工作: 首先,构建及鉴定荧光素酶报告质粒pGL2-PEPCK-Luc。从质粒pPEPCK-int上用限制性内切酶切取大小为550bp左右的PEPCK启动子片段,通过过渡载体质粒PBS-SK,构建含有PEPCK启动子片段的的过渡质粒PBS-PEPCK。并在此基础上构建成功真核细胞表达的荧光报告质粒pGL2-Basic-Luc,经核苷酸序列测定,证实质粒连接位点正确,重组片段序列与GeneBank资料一致,未发现核苷酸突变或丢失。 随后,通过脂质体(Lipofectin)转染法将构建的报告质粒与内对照质粒pSV-β-Galactosidase共同转染大鼠肝肿瘤细胞系(CBRH7919),以不含任何启动子的pGL2-Basic-Luc质粒作为荧光素酶表达活性对照,设定背景荧光强度为1,结果显示,细胞转染pGL2-PEPCK-Luc与pGL2-Basic-Luc质粒后,荧光素酶表达的相对活性分别为11.75±1.54vs1.36±0.18,P<0.01。证明重组质粒在CBRH7919细胞内能够使表达荧光素酶,为下一步研究PEPCK启动子的转录调节奠定了基础。 最后,研究PEPCK启动子序列在肝细胞内对报告基因转录的调节作用。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:R735.7

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