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《中国协和医科大学》 1999年
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应用差减杂交法分离大鼠压力负荷型心肌肥厚的相关基因

潘德思  
【摘要】:心肌肥厚是心血管疾病常见的临床症状,它与冠心病、心衰、脑卒中等心血管疾病均密切相关,其发生机制目前仍不清楚。近年来关于各种重大疾病相关基因的分离已成为揭示疾病发病机制的重要研究内容,而分离心肌肥厚的相关基因将为阐明其发生的分子机制及其预防和治疗提供有益的线索。 方法:本文的研究是基于心肌肥厚过程中各种基因在表达上所发生的变化,选用腹主动脉绑扎的左心室肥厚大鼠为模型,运用差减杂交法,旨在分离心肌肥厚过程中的相关基因。首先采用常规的腹主动脉缩窄法(雄性健康Wistar大鼠,体重200克左右)建立压力负荷型左心室肥厚大鼠模型,在实验设计上根据术后的不同时期(术后一天、三天和术后四周)从组织和细胞水平上同时进行研究。分别采取直接取用左心室心肌组织和灌流分离左心室心肌细胞两种处理方式,共分六组材料(每组均包括模型动物和对照);经过RNA提取和反转录合成cDNA,将cDNA两端补平并加上合成接头(接头序列为:5′>ctcttgcttgaattcggact<3′;5′>agtccgaattcaagcaa<3′),以接头的一条链(5′>ctcttgcttgaattcggact<3′)作为引物扩增cDNA,随后在每组内进行差减杂交;差减杂交4—5轮后,剩下的cDNA片段以EcoRI酶切后插入载体pBluescript-KS的多克隆位点,重组质粒转化受体菌JM109,经蓝白斑筛选后建立差减文库;经过菌落原位杂交(以差减杂交后剩下的cDNA分别作为探针),挑选出每组中用模型组和对照组为探针的杂交间信号强度有明显差异的作为阳性克隆子;再以提取的阳性克隆子重组质粒作斑点杂交(以差减杂交前接有接头的原始cDNA分别作为探针),挑出其中杂交信号有差异的克隆子;最后对其中的部分克隆子进行序列测定和同源性比较。 结果:(1)在三个不同时期的六组材料中共分离出三十六个差异性表达的基因片段,其中以心肌组织作为材料分离出二十四个片段(从第1天心肌组织中分离得到4个差异片段,第3天心肌组织中得到13个,第4周心肌组织中得到7个);以灌流分离的心肌细胞作为材料得到十二个片段(第1天灌流分离的心肌细胞中得到6个差异片段,第3天灌流分离的心肌细胞中得到4个差异片段,第四周灌流分离的心肌细胞中得到2个差异片段);部分阳性克隆子经过酶切鉴定显示其中插入片段的大小从200bp至500bp左右不等;菌落原位杂交和斑点杂交的结果显示它们在心肌肥厚组和对照组中确实存在表达差异。(2)通过测序和同源性比较,发现从心肌组织和心肌细胞两种材料中得到的差异性片段只有较少的重复(仅有细胞色素b和Rab11b基因的同源片段出现重复),表明两者反映的是心肌肥
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:1999
【分类号】:Q789

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【参考文献】
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【共引文献】
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