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《中国协和医科大学》 1999年
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大鼠精子发生阶段特异表达基因的分离和表达

刘辉贤  
【摘要】:精子发生是一系列基因严格按照时空顺序相继转录表达的过程。寻找和研究不同时期、不同发育阶段的差异表达基因,将有助于最终阐明精子发生的机理。由于大鼠生精细胞在曲细精管内的排列极为有序,本研究采用曲细精管分段分离结合差异显示PCR(DDRT-PCR)的方法,寻找精子发生中差异表达的基因。 在解剖显微镜下根据折光度不同将曲细精管分出Ⅱ~Ⅵ期和Ⅶ~Ⅷ期两段,Ⅱ~Ⅵ期中包含精原细胞分裂产生A、B两型精原细胞、变形期初级精母细胞向粗线期精母细胞的转化和2~6级以及15~18级精细胞,Ⅶ~Ⅷ期中包含A型精原细胞、休止型精母细胞、粗线期精母细胞、7~8级和19级精细胞以及成熟精子的释放,Ⅶ~Ⅷ期中不含细胞分裂。提取两段的组织总RNA并反转录成cDNA,以3个Oligo-dT_(12)N(N为A、C、G)单锚定引物分别与上游8个随机引物进行24种配对组合,共48个扩增反应,经聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影后选出112个差异cDNA条带,再经反向Northern斑点杂交验证,有76个cDNA条带代表的基因在不同区段中存在差异转录,其中17个差异达10倍以上。对36个有差异的cDNA条带进行克隆测序,得到22个彼GenBank接收的新的Expression Sequence Tags(ESTs),其中来自Ⅱ~Ⅵ期的有14个(AF094604、AF094605、AF094606、AF094607、AF095318、AF095320、AF095321、AF095322、AF095324、AF095325、AF096087、AF096088、AF096089、AF134584、),来自Ⅶ~Ⅷ期的有8个(AF095319、AF095323、AF096090、AF133655、AF133656、AF133287、AF133288、AF133289)。 在此基础上,选择6个ESTs作为混合探针筛选大鼠睾丸cDNA文库,得到一新的全长2183bp、编码526个氨基酸的cDNA序列(GenBank接收号为AF094609),命名为R337,其编码蛋白的预测分子量为60000,等电点为4.0,经蛋白数据库分析发现其氨基酸序列存在一个P34cdc2的磷酸化位点、一个蛋白激酶A(PKA)磷酸化位点、多个蛋白激酶C(PKC)和酪蛋白激酶Ⅱ(CK-Ⅱ)的磷酸化位点以及多个DNA结合Motif。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:1999
【分类号】:Q344

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