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小鼠睾丸生殖细胞凋亡及相关基因调控的研究

徐健  
【摘要】:越来越多的证据表明:细胞凋亡是精子发生过程中生精细胞主动退化的机制,而激素、温度等都是生精细胞凋亡的重要调节因素。但是,这些细胞外的调节因素,必须激活生精细胞内部某些基因的转录、表达,才能诱导细胞这种主动自杀行为。目前,虽然生精细胞凋亡的研究已成为一个热点,但从基因水平上研究生精细胞凋亡的报道还比较少。本实验的研究目的,即是想通过在体和离体的实验,探讨细胞凋亡的重要调节基因bcl-2、bax及hsp70基因是否参与生精细胞凋亡的调节以及怎样调节生精细胞凋亡,为更深入地探索生精细胞主动退化的分子机制提供一些基础理论和实验依据。 首先,我们通过将成年小鼠的睾丸推入腹腔,然后缝合单侧腹股沟管的方式,建立了体内实验隐睾诱导生精细胞凋亡的模型。结果发现:隐睾术后6-15d,术侧睾丸重量明显下降,与对照例有显著差异(P<0.01)。组织学观察显示:术后6-15d,一些生精细胞剥脱至管腔,生精上皮变薄不完整,空化现象明显,大量生精细胞丢失,成熟精子明显减少甚至消失,一部分生精细胞的核染色质浓缩,明显边集化,呈环状,出现典型的细胞凋亡特征。管腔中出现“多核巨细胞”(Multinucleated giant cells,MGC),即多个细胞核聚集形成一个大的细胞团块,其中的一些细胞核染色质也明显边集化,呈环状。光镜下未见间质细胞和支持细胞有明显变化。TUNEL染色显示:正常及对照侧睾丸有一些曲细精管中可观察到个别凋亡细胞,主要为精原细胞及初级精母细胞。隐睾术后3d无明显变化,术后6-15d阳性曲细精管(含凋亡细胞的曲细精管)及阳性细胞(凋亡细胞)均明显增加(P<0.05),以术后8d、10d最为显著,达到峰值。凋亡细胞主要为精母细胞、精子细胞及精原细胞,部分“多核巨细胞”也呈阳性。未见间质细胞及支持细胞凋亡。组织DNA凝胶电泳显示隐睾术后6-10d可见“DNA ladder”图谱,显示有DNA断裂的小片断存在,而相应的对照侧、隐睾术后3d及正常小鼠睾丸没有观察到小片断DNA。 在体外实验中,我们将分离的精原细胞、精母细胞和精子细胞置于41℃中培养0.5h、1h、2h和12h,对照组33℃培养,结果发现:41℃培养30min后,精原细胞有少量凋亡,精母细胞和精子细胞的凋亡明显增加,1h后,凋亡均显著升高。而混合培养的生精细胞,在30min、1h可见明显的DNA ladder小片断,2h及12h则主要以坏死细胞造成的弥散小片断DNA为主。 bcl-2基因是1984年Tsujimoto等从滤泡性B淋巴细胞瘤中分离出来的一种


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