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腺病毒介导凝血酶敏感蛋白1抗血管新生衍生物基因转移及其抑制肿瘤生长效应的实验研究

刘澎  
【摘要】:研究背景 新近研究表明血管新生(angiogenesis)是恶性肿瘤包括造血系统恶性肿瘤发病机制中的关键因素。肿瘤细胞分泌血管形成的刺激因子;新生血管为肿瘤细胞输送生长必需的氧气、营养物质和生长因子;缺乏血供的肿瘤组织将处于静息状态数月至数年之久并且直径不会超过2-3 mm。白血病患者骨髓微血管密度(microvessel density,MVD)及血浆血管新生正调控因子水平多有增高,这一现象又往往提示预后不良。某些抗血管新生药物已经在恶性肿瘤的治疗中取得了可喜的疗效。凝血酶敏感蛋白1(thrombospondinl,TSP1)是第一个被发现的内源性多肽类血管新生抑制剂。已有研究表明TSP1可以抑制多种恶性实体肿瘤组织内的血管新生和肿瘤进展。目的 探讨腺病毒介导的TSP1抗血管新生衍生物(TSP1_f)基因转移对人白血病细胞株K562裸鼠移植瘤的抑制活性及作用机制。方法 应用RT-PCR方法从正常人外周血单个核细胞扩增TSP1_f cDNA序列;采用AdEasy System构建TSP1_f重组腺病毒ADV-TSP1_f;Western blot方法检测ADV-TSP1_f导TSP1_f在K562细胞中的表达;台盼蓝拒染实验检测经ADV-TSP1_f感染的K562细胞条件培养基对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)刺激的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增殖的抑制作用;MTT法观察ADV-TSP1_f感染对K562细胞体外增殖的影响;皮下移植瘤模型治疗实验观察ADV-TSP1_f对K562细胞裸鼠体内生长的抑制作用;免疫组化方法比较移植瘤内MVD。结果 从正常人外周血单个核细胞成功克隆出TSP1_f cDNA序列,经自动测序仪测定与GENE BANK内登载的TSP1相应序列完全一致;利用AdEasy System以细菌内同源重组法可高效制备TSP1_f重组腺病毒,病毒滴度为1.0×10~(11)pfu/mL;K562细胞经ADV-TSP1_f感染可高效表达/分泌TSP1_f多肽;经ADV-TSP1_f感染的K562细胞条件培养基可显著抑制VEGF刺激的HUVECs增殖,以ADV-LacZ及PBS作对照,抑制率分别为60.0%和61.4%;治疗后3周ADV-TSP1_f治疗组移植瘤体积[(1107.70±179.03)mm~3]远小于ADV-LacZ组[(4518.25±451.85)mm~3]及PBS组[(4665.57±457.74)mm~3],


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