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Ad5E1A蛋白的表达、抗癌作用和相关新基因片段的筛选及在克服DXR中的功能研究

马业伟  
【摘要】:人腺病毒5型E1A具有较强的抑癌作用及显著的化、放疗增敏作用。首先构建了E1A真核表达载体,转化毕赤酵母细胞,筛选高表达重组菌株,获得纯化的E1A蛋白。E1A蛋白转入LN686细胞主要定位在细胞核中,有效的阻滞细胞周期在G2/M期,显著抑制LN686肿瘤细胞的生长,并能提高LN686细胞对化疗药物的敏感性;在体内E1A蛋白显著抑制S-180肿瘤、LN686肿瘤生长,诱导其凋亡,并提高S-180肿瘤对博莱霉素的敏感性。以E1A蛋白处理的LN686细胞为tester,以亲本LN686细胞为driver,提取mRNA,反转录构建消减cDNA文库,文库包含7000个阳性克隆,随机挑取384个克隆进行PCR分析,其中362个有插入片段,其中10个为新ESTs,斑点杂交和RT-PCR证实这些基因在tester中高表达。用截短的E1A基因(E1AΔ)包括功能区(1~80aa)和核定位区(139~243aa),将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,并转染PAEC,获得稳定表达细胞株,E1AA基因能在PAEC中稳定表达,且E1A蛋白定位到细胞核中;E1AΔ对NF-κB的抑制率为53%,并能抵抗TNF-α诱导的细胞凋亡,且不影响细胞的正常生长;对NF-κB信号转导途径下游的一个关键炎症基因E-选择素的表达抑制率达63%。综上,采用E1A蛋白代替其基因治疗肿瘤、筛选新的抗肿瘤相关基因片段及用改造后的E1A基因克服DXR在国内外尚未见报道,本工作为E1A的功能研究增添了新的内容。


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