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HIV-1 RNA双重实时荧光RT-PCR测定方法及其质控物和标准物质的系列研究

黄杰  
【摘要】: 目的 建立新型的采用病毒样颗粒作为内质控的HIV-RNA双重实时荧光RT-PCR测定方法。制备无生物传染危险性且耐RNase的HIV-IRNA检测血清质控物和标准物质,用于临床实验室的室内质量控制和室间质量评价工作。 方法 一、HIV-RNA双重实时荧光RT-PCR测定方法 1.从美国Los Alamos国家实验室网站和NCBI网站下载所有已知HIV—1序列,采用DNAMAN和BioEdit软件进行比对,获取HIV-1序列的保守区域序列。再利用软件Primer Express(美国应用生物系统公司)进行实时荧光PCR引物和探针设计,并初步建立实时荧光PCR检测体系。 2.在上述的HIV-1 RNA实时荧光PCR检测体系中,加入上面设计的不同的探针和引物,检测本室构建表达的内含HIV-1 RNA的病毒样颗粒和HIV-1感染患者样本,筛选合适的引物和探针。初步确定了双引物双探针的检测体系。根据双引物双探针体系构建重组质粒表达内含HIV-1 RNA内标的病毒样颗粒,确定内标病毒样颗粒在反应体系中的最适浓度。通过不同添加剂的加入和不同酶混合物的调整优化RT-PCR反应体系。 3.采用两条不同的荧光探针和两组引物进行国际标准血清盘和HIV-1感染者血清标本的HIV-1RNA检测,并利用上述构建表达的病毒样颗粒作为内标以进行假阴性质控,考察了所建立方法的检测灵敏度和特异性。比较了单探针和双探针检测方法在亚型检测能力、检测灵敏度和临床样本的检测适用性。 二、MS2包膜蛋白的原核表达、纯化以及抗MS2蛋白多克隆抗体的制备及其与RNA的体外相互作用 1.构建表达包膜蛋白的pET_(42)-COAT、pGEX-4t-1-COAT原核表达质粒和pcDNA3.1-COAT真核表达质粒。原核表达重组MS2包膜蛋白。将重组蛋白利用亲和柱进行纯化,纯化后的包膜蛋白进行尿素梯度透析。 2.分别采用原核表达重组蛋白免疫1号和3号两只家兔、采用真核质粒DNA免疫2号和4号两只家兔,制备抗MS2蛋白的多克隆抗体。 3.配制体外包装缓冲液,加入包膜蛋白与体外转录的RNA分子,加入适量RNA酶抑制剂。4℃过夜,电泳观察迁移率变动情况。 三、无生物传染危险性HIV-1 RNA测定质控物和标准物质的制备和室间质量评价应用的研究 1.无生物传染性的HIV-1 RNA测定质控物和标准物质大量原核表达,采用两次超速离心进行纯化,获得大量HIV-1病毒样颗粒。 2.研究HIV-1 RNA测定质控物和标准物质在37℃、室温、4℃、-20℃以及-70℃至室温反复冻融5次的样本稳定性。同时研究质控物和标准物质的均匀性,并采用匹基公司HIV-1核酸检测试剂盒和COBAS AmpiCOt HIV-11.5 Monitor试剂与HIV-1 RNA国际标准物质进行比对定值。 3.调查开展HIV-1 RNA检测的实验室,每个实验室发放20份样本同时附带相同的操作说明及结果报表,开展临床实验室室间质量评价。 结果 一、HIV-1双重实时荧光RT-PCR测定方法 通过比对设计了对引物探针,经过筛选建立了双引物双探针体系。采用1000拷贝/ml的病毒样颗粒作为内部假阴性质控,建立的双特异探针检测HIV-1实时荧光RT-PCR方法的灵敏度为125IU/ml,和单探针方法比较不存在大的差别;在检测HIV-1阴性样本时具有100%的特异性。和单探针方法比较,双特异探针检测HIV-1实时荧光RT-PCR方法在HIV-1亚型检测中能检测到M族的所有亚型以及O族:双特异探针检测HIV-1实时荧光RT-PCR检测体系检测中国药品生物制品检定所提供的9株国内流行株B、C、CRF01-AE、CRF07-BC、CRF08-BC的分型血清时均能检出;在对60份临床样本的检测中,单探针方法只能检出39份,而双探针方法能检出50份(10份检测阴性的样本用COBAS检测证明为阴性)。 二、MS2包膜蛋白的基因工程表达纯化、抗MS2蛋白多克隆抗体的制备及其与RNA的体外相互作用 完成了MS2包膜蛋白的原核表达和纯化。通过质粒免疫和重组蛋白免疫的方法获得了抗MS2包膜蛋白的多克隆抗体,1和3两只家兔血清在稀释1280000倍后仍然可以与重组MS2包膜蛋白反应,而2和4两只家兔血清只能在8000倍左右稀释后呈现阳性反应。从RNA迁移率改变实验证明了包膜蛋白可以和包装位点具有特异性相互作用,但经过RNaseA的消化后RNA条带消失,说明了RNA和包膜蛋白的在体外发生了作用但未能形成完整的病毒样颗粒。 三、无生物传染危险性HIV-1 RNA测定质控物和标准物质的制备和室间质量评价应用的研究 无生物传染危险性的HIV-1 RNA测定质控物和标准物质在37℃、室温、-20℃以及2-8℃保存情况下其性能并无明显改变。在室温条件下能稳定3周;在37℃条件下能稳定10天;-20℃以及2-8℃保存情况下能稳定4周以上;反复冻融5次对无生物传染危险性的HIV-1核酸检测参考品没有明显影响;无生物传染危险性的HIV-1 RNA测定质控物和标准物质均匀性良好,适合临床使用和开展临床实验室室间质量评价,从而保证临床检测质量。病原体核酸检测的主要问题在于低浓度样本的检测。病原体核酸检测质量保证还需要进一步做好室内质控和参加室间质量评价来进行保证。 结论 建立的双引物双特异探针检测HIV-1实时荧光RT-PCR方法具有很高的检测灵敏度以及HIV-1亚型的检测能力。在对临床样本的检测中证明具有很好的临床适用性。因此,该方法具有良好的应用前景。 无生物传染危险性的HIV-1 RNA测定质控物和标准物质稳定性和均匀性良好,适合临床HIV-1 RNA RT-PCR检测的质量保证,对临床实验室的HIV-1 RNA RT-PCR检测室间质量评价具有重要的应用价值。


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