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《中国协和医科大学》 2007年
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缝隙连接蛋白在肺动脉高压及右室重塑发病机制中的作用

谭晓燕  
【摘要】: 缝隙连接蛋白在肺动脉高压发病机制中的作用 目的:探讨缝隙连接蛋白(Connexin,Cx)在野百合碱(monocrotaline,MCT)所诱导的大鼠肺动脉高压发病机制中的作用。 方法:通过腹腔内注射MCT(60mg/kg)的方法建立肺动脉高压大鼠模型,两周后肺动脉高压大鼠被随机分组。实验大鼠具体分组如下:A组:正常对照大鼠+安慰剂(n=10),安慰剂为5%的阿拉伯树胶,剂量为4ml/kg/天,通过胃管一次性喂入,共计三周。B组:肺动脉高压大鼠+安慰剂(n=35),安慰剂为5%的阿拉伯树胶,剂量为4ml/kg/天,通过胃管一次性喂入,共计三周。C组:肺动脉高压大鼠+Bosentan(n=22),Bosentan的剂量为100mg/kg/天,以5%的阿拉伯树胶按4ml/kg/天作为溶剂,通过胃管一次性喂入,共计三周。测定各组血流动力学指标、通过肺组织的(ET+VG)染色(切片厚度5um)在光镜下测定肺小动脉的中层平滑肌厚度和血管外周直径的比值(the percent wall thickness,%WT)、通过肺组织的HE染色(切片厚度5um)在光镜下进行肺小动脉的组织形态学观察及通过肺组织的醋酸铀和硝酸铅染色(100nm超薄切片)在透射电镜下观察肺小动脉的超微结构,并通过免疫荧光的方法(切片厚度6um)测定各组缝隙连接蛋白Cx43和Cx37在肺小动脉中层平滑肌细胞间和内皮细胞间的表达变化。 结果:①五周生存率:A组、B组及C组的五周生存率分别为100%(10/10)、31.43%(11/35)及45.45%(70/22),经χ~2检验/四格表的确切概率法,B组和C组之间差别无显著性(0.25<P<0.50),A组和B、C组之间差别显著(P=0.000)。②血流动力学指标:A组、B组及C组的肺动脉平均压分别为16.96±2.59mmHg、26.55±6.80mmHg及20.27±6.48mmHg,经单因素ANOVA分析,A组和B组之间差别显著(P=0.002),B组和C组之间无明显差别(P=0.124),A组和C组之间无明显差别(P=0.407);A组、B组及C组的右房压分别为0.87±0.71mmHg、9.71±5.10mmHg及6.70±2.26mmHg,经单因素ANOVA分析,A组和B组之间差别显著(P=0.001),B组和C组之间无明显差别(P=0.265),A组和C组之间差别显著(P=0.000);A组、B组及C组的颈动脉平均压分别为130.15±22.95mmHg、57.98±6.89mmHg及80.28±10.01mmHg,经单因素ANOVA分析,三组之间两两比较均差别显著(P值均为0.000)。③(%WT):A组、B组及C组的(%WT)分别为21.10±2.99%、34.36±2.84%及26.85±3.61%,经单因素ANOVA分析,A组和B组之间差别显著(P=0.000),B组和C组之间差别显著(P=0.000),A组和C组之间差别显著(P=0.000)。④光镜下的组织形态学变化:A组中肺小动脉管壁薄而规则,B组中肺小动脉壁内膜增生,中层平滑肌细胞、弹力纤维增加导致中层增厚,引起管腔变小甚至闭塞。而C组的病理改变介于A组和B组之间。⑤电镜下的超微结构变化:Ⅰ.肺小动脉内膜:A组:内皮细胞胞体扁平;B组:内皮细胞突起,呈立方型,细胞核体积增大,呈分叶状,内膜部分突入管腔,基底膜增厚;C组的病理改变介于A组与B组之间。Ⅱ.肺小动脉中膜:A组:平滑肌细胞0~2层:B组:平滑肌细胞可达3~4层,细胞胞体肥大,中膜明显增厚;C组的病理改变介于A组与B组之间。Ⅲ.肺小动脉内皮细胞间的缝隙连接:在三组的肺小动脉内皮细胞间均可见缝隙连接,但后二者的结构较A组略欠清晰。⑥肺小动脉中层平滑肌细胞间和内皮细胞间缝隙连接蛋白Cx43及Cx37的免疫荧光检测:A组肺小动脉内皮细胞间未检测到Cx43,而在B组及C组,内皮细胞间均可见Cx43表达,且C组少于B组;三组肺小动脉内皮细胞间均可见Cx37的表达;三组肺小动脉中层平滑肌细胞间均未检测到Cx43:三组肺小动脉中层平泪.肌细胞间是否存在Cx37尚不能确定。 结论:①Bosentan治疗MCT所诱导的肺动脉高压是有效的。②Bosentan治疗肺动脉高压的机制除已知的抑制肺血管平滑肌细胞的增殖及收缩外,抑制肺小动脉内皮细胞间Cx43的表达很可能也是机制之一。③有理由推测肺小动脉内皮细胞间Cx43的异常表达在肺动脉高压的发病机制中起着非常重要的作用。 缝隙连接蛋白在右室重塑发病机制中的作用 目的:探讨缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)在野百合碱(monocrotaline,MCT)所诱导的大鼠肺动脉高压所致右室重塑发病机制中的作用。 方法:通过腹腔内注射MCT(60mg/kg)的方法建立肺动脉高压大鼠模型,两周后肺动脉高压大鼠被随机分组,实验大鼠具体分组如下:A组:正常对照大鼠+安慰剂(n=10),安慰剂为5%的阿拉伯树胶,剂量为4ml/kg/天,通过胃管一次性喂入,共计三周。B组:肺动脉高压大鼠+安慰剂(n=35),安慰剂为5%的阿拉伯树胶,剂量为4ml/kg/天,通过胃管一次性喂入,共计三周。C组:肺动脉高压大鼠+Bosentan(n=22),Bosentan的剂量为100mg/kg/天,以5%的阿拉伯树胶按4ml/kg/天作为溶剂,通过胃管一次性喂入,共计三周。测定各组血流动力学指标和RV/LV游离壁厚度比,通过右室心肌组织的HE+PTH染色(切片厚度5um)在光镜下进行组织形态学观察及通过醋酸铀和硝酸铅染色(100nm超薄切片)在透射电镜下观察心肌组织的超微结构,并通过免疫荧光(切片厚度10um)和激光共聚焦显微镜的方法测定各组缝隙连接蛋白Cx43在右室心肌中的分布及表达量的变化。 结果:①血流动力学指标:A组、B组及C组的右室收缩压分别为25.18±3.31mmHg、34.27+4.21mmHg及28.62±4.58mmHg,经单因素ANOVA分析,A组和B组之间差别显著(P=0.000),B组和C组之间差别显著(P=0.004),A组和C组之间差别无显著性(P=0.069)。右室收缩压与颈动脉收缩压的比值在A组、B组及C组分别为17.78±4.58%、51.68±8.87%及33.26±6.94%,经单因素ANOVA分析,三组之间两两比较均差别显著(P值均为0.000)。②RV/LV游离壁厚度比:A组、B组及C组的RV/LV游离壁厚度比分别为42.96±5.32%、77.64±16.58%及68.73±4.20%,经单因素ANOVA分析,A组和B组之间差别显著(P=0.000),B组和C组之间差别无显著性(P=0.300),A组和C组之间差别显著(P=0.000)。⑧光镜下的组织形态学变化:同A组相比,B组心肌细胞明显肥大,其细胞核也增大,部分肌纤维疏松,出现间质明显纤维化;而C组的病变介于二者之间。④电镜下的超微结构变化:Ⅰ.心肌细胞:A组心肌纤维整齐排列,线粒体结构完整;B组的心肌部分肌纤维溶解、结构疏松,内质网扩张,线粒体肿胀;C组的病理改变介于A组与B组之间。Ⅱ.间质:A组间质未见纤维化;B组部分间质出现明显纤维化;C组的病理改变介于A组与B组之间。Ⅲ.缝隙连接:A组的缝隙连接在闰盘处较多、较长;在侧-侧连接处较少、较短。B组的缝隙连接在闰盘处减少、缩短,而在侧-侧连接处明显增多、增长;C组的缝隙连接介于前二者之间。⑤右室心肌细胞间缝隙连接蛋白Cx43的免疫荧光共聚焦显微镜的检测:Ⅰ.分布:在右室心肌纵切面,A组的Cx43多数集中于与心肌细胞长轴垂直的端—端连接处,少数位于与长轴平行的细胞侧—侧连接处;而在B组,Cx43的表达在端—端连接处明显减少,在侧—侧连接处明显增加,即分布趋向于整个心肌细胞表面;C组的Cx43的分布与A组相似。Ⅱ.半定量分析:经单因素ANOVA分析,单位面积的右室心肌中Cx43的表达面积在A组(2.29±0.69)、B组(2.78±1.2)和C组(2.62±1.07)中均无明显差异(P=0.149)。 结论:①Bosentan可以部分逆转右室的重塑;②Bosentan部分逆转右室重塑的机制除了降低了肺血管阻力、肺动脉压及干扰了内皮素—1(endothelin-1,ET-1)导致心室肥厚的作用外,影响心肌细胞间Cx43的空间分布很可能也是机制之一;③有理由推测右室心肌缝隙连接蛋白Cx43的分布紊乱很可能是导致右室重塑的机制之一。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R543.2

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