收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

基于靶向肽的强化融合蛋白和化学偶联物的制备与抗肿瘤作用研究

郑艳波  
【摘要】: 小型化、高效化是靶向抗肿瘤药物的发展趋势,与抗体及其片段相比,靶向肽具有分子量更小、免疫原性更弱的优点。本论文第一部分通过基因工程的方法制备CD13靶向肽NGR(Asn-Gly-Arg)与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白,再通过分子强化技术组装发色团,得到有活性的强化融合蛋白,并对其体内外抗肿瘤活性进行研究。第二部分通过化学方法合成抗黏附肽RGD(Arg-Gly-Asp)与云南霉素(yunnanycin,YNM)的偶联物,并研究其抗肿瘤活性。 1.CD13靶向肽与力达霉素强化融合蛋白的制备及抗肿瘤活性 NGR-CD13是良好的肿瘤新生血管靶向系统,NGR序列与肿瘤血管内皮细胞表达的CD13异构体特异结合。力达霉素(lidamycin,LDM,又叫C1027)是大分子肽类抗肿瘤抗生素,由辅基蛋白(lidaprotein,LDP)和活性烯二炔发色团(active enediyne,AE)构成,发色团具有很强的细胞毒作用但不稳定,辅基蛋白对发色团起保护作用。LDP和AE以非共价键结合,可以拆分和重建,重建后的蛋白具有同样的细胞毒作用,这为体外LDP融合蛋白与AE的分子重建提供了基础。本研究先通过基因工程的方法制备NGR肽与LDP的融合蛋白,再通过分子强化组装发色团,得到有活性的强化融合蛋白,并对其体内外抗肿瘤活性进行研究。 以含ldp基因的质粒pEFL为模板,通过PCR的方法得到含信号肽pelB、NGR和LDP编码序列的融合基因sngrldp,信号肽的表达可以使目的蛋白最终分泌到周质腔,同时在sngrldp基因两端加入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点。PCR产物长约0.4kb,将PCR产物通过T4 DNA连接酶连接到T载体,酶切及PCR鉴定后测序。测序无误后,将T载体进行NdeⅠ/XhoⅠ双酶切,得到含粘末端的sngrldp片段,再通过T4 DNA连接酶连接到经同样酶切的pET30a(+)表达载体中。酶切鉴定无误后,将构建好的表达载体转化表达菌E.coli BL21(DE3)star~(TM)。确认发酵液中有目的蛋白表达后,对发酵条件进行优化。最终确定的诱导条件为:菌体起始密度OD_(600)为0.8,IPTG浓度0.05 mM,诱导时间8 h。对目的蛋白纯化前,先通过硫酸铵沉淀法浓缩目的蛋白,硫酸铵浓度为60%饱和度。由于pET30a(+)载体上带有His·Tag标签,故采用NPNTA His·Bind树脂对目的蛋白进行纯化。纯化后的蛋白定量分析,每升发酵液可得到纯度在95%以上的目的蛋白约10mg。纯化产物还原电泳和非还原电泳均得显示单一条带,巯基含量检测发现自由巯基含量约为0.687%,说明NGR-LDP已折叠为正确构象,且并未形成链间二硫键。 ELISA法检测NGR-LDP对肿瘤细胞的结合活性,同时以不含NGR序列的rLDP为对照。结果表明NGR-LDP与人纤维肉瘤HT-1080细胞和人乳腺癌MCF-7细胞均能结合,且结合呈浓度剂量依赖性;而rLDP与这两种细胞均无结合。NGR肽能抑制NGR-LDP(50μM)与靶细胞的结合,0.2 mM的NGR肽抑制率约为36.3%,1 mM的NGR肽抑制率约为46.6%。由此进一步确定结合序列为CNGRC。同时Western-blot检测发现HT-1080和MCF-7细胞中均有CD13表达。 将力达霉素进行甲醇拆分后得到活性发色团AE,将NGR-LDP与发色团按摩尔比1:5进行组装,经PD-10柱分离,去除多余的发色团,得到NGR-LDP-AE。对产物全波长扫描,发现在340nm和280nm均有吸收峰,而NGR-LDP只在280nm有吸收峰,由于340nm是发色团的特征吸收峰,由此认为融合蛋白已成功组装为NGR-LDP-AE。力达霉素纯品的A_(280)/A_(340)比值约为2:1,强化后的融合蛋白比值约为3.1:1,因而认为未实现1:1组装,计算重组蛋白中发色团的组装率大约为65%。 MTT法检测NGR-LDP-AE对HT-1080和MCF-7细胞的杀伤作用。强化融合蛋白对HT-1080和MCF-7细胞作用48 h的IC_(50)值分别为1.94×10~(-9)M和2.67×10~(-9)M,LDM为1.08×10~(-10) M和2.44×10~(-10) M。而NGR-LDP对两种细胞均无杀伤作用。与力达霉素相比NGR-LDP-AE细胞毒作用下降。本研究发现辅基蛋白对强化融合蛋白的活性有抑制作用,10 nM的rLDP与1 nM的LDM共同作用0.5 h后,洗掉药物,再继续作用48 h,与1 nM的LDM单独作用相比,存活率由62.2%上升到77.4%;两药共同作用48 h存活率由43.3%上升到58.8%。rLDP和NGR-LDP对NGR-LDP-AE的活性也有抑制作用,5 nM的NGR-LDP-AE单独作用0.5 h后,洗掉药物,继续培养48 h,存活率为32.8%;当加入10 nM rLDP或NGR-LDP时,存活率上升为64.5%和62.3%。100 nM BSA使存活率上升为55.67%。尽管高浓度BSA也能抑制NGR-LDP-AE的细胞毒性,但较辅基蛋白为弱,说明LDP对NGR-LDP-AE的抑制有特异性。 体内实验采用昆明小鼠皮下移植性肝癌H22模型,分别于接种后3天和10天尾静脉注射给药两次。实验结果显示强化融合蛋白对肿瘤的生长有强烈的抑制作用,实验第16天0.2 mg/kg、0.4 mg/Kg和0.8 mg/Kg三个剂量组的NGR-LDP-AE抑瘤率分别为59.8%、77.8%和94.8%,0.05 mg/kg的游离力达霉素(耐受剂量)抑瘤率为66.9%,未经强化的融合蛋白NGR-LDP基本无抑瘤作用。治疗期间动物体重没有减轻,没有观察到其它明显的毒副作用,表明所用剂量为可耐受剂量。 2.云南霉素与抗黏附肽RGD偶联物的合成及其抗肿瘤活性 抗黏附肽RGD(Arg-Gly-Asp)的受体是细胞表面的整合素(integrin),通过制备RGD与云南霉素的偶联物,使终产物既具备RGD肽抗黏附的功能,又具有云南霉素杀伤细胞的能力。 云南霉素的羟基、氨基用叔丁氧甲酰基(Boc)保护,RGD的羧基用甲酯基(OMe)保护;以2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)为缩合剂,使云南霉素的羧基与RGD的氨基缩合得到偶联物;薄层层析(TLC)监测反应进程。利用硅胶制备板对产物进行分离纯化。质谱分析发现终产物终含有分子量分别为773 Da、801 Da和901 Da的成份,分别对应于YNM-RGD、YNM-RGD(OMe)_2和YNM(Boc)-RGD(OMe)_2;HPLC分析三种化合物的总含量为87.16%。MTT显示偶联物和云南霉素对PG细胞的IC_(50)值分别为O.129 mM和0.01 mM,对Bel-7402细胞的IC_(50)值为0.135 mM和0.029 mM,0.1 mM的RGD对两种细胞均无明显的细胞毒作用;1 mM时偶联物、云南霉素和RGD对PG细胞的抑制率分别为73.1%、91.8%和16.9%。Boyden chamber显示0.1 rnM时偶联物和RGD对PG细胞跨膜的抑制率分别为50.9%和40.8%;0.2 mM时为66.4%和56.2%;0.4mM时为66.6%和57.1%;O.1 mM的云南霉素对PG的细胞跨膜能力无明显影响。偶联物兼有云南霉素和RGD的生物活性;与云南霉素相比,偶联物的细胞毒作用下降,但与RGD相比仍有较强的细胞毒作用;YNM-RGD在体外具有抗侵袭的能力,其作用与浓度呈依赖关系。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 孙华;胡春;方唯硕;;3-氧代齐墩果酸氨基酸偶联物的合成、水溶性的测定及抗肿瘤活性研究[J];中国药物化学杂志;2008年01期
2 郭晓芳;钟根深;苗庆芳;甄永苏;;靶向表皮生长因子受体的寡肽与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性[J];癌症;2009年06期
3 郑艳波;许先栋;黄云虹;甄永苏;;云南霉素-RGD二甲酯偶联物的合成及其抗肿瘤细胞侵袭活性[J];中国抗生素杂志;2009年02期
4 李忠东;;趋化肽fMLP与博安霉素偶联物制备及其体内抗肿瘤活性的初步评价[J];中国药师;2010年01期
5 卞益民;;田青属植物Sesbania drummondii的抗肿瘤活性研究[J];国外医药.植物药分册;1982年02期
6 李琪;梁燕;张晶晶;冯利杰;王海萍;沈玉先;;tau蛋白的直接细胞毒作用[J];毒理学杂志;2007年04期
7 杨连君,司晓辉;McAb与SAg偶联物或其融合蛋白抗肿瘤作用的实验研究进展[J];细胞与分子免疫学杂志;1996年04期
8 庞冀燕,汪波,蔡于琛,杨华,冼励坚,许遵乐;2,4,5,7-取代芳基苯并[b]呋喃类化合物的合成及其抗肿瘤活性[J];中山大学学报(自然科学版);2005年05期
9 丁建弥;豆科植物Sesbania drummondii抗肿瘤活性的研究[J];国外医学.药学分册;1982年01期
10 成晓静;刘华钢;赖茂祥;;莪术的化学成分及药理作用研究概况[J];广西中医学院学报;2007年01期
11 邵荣光,甄永苏;新抗癌抗生素C1027及其单克隆抗体组装偶联物的抗肿瘤活性[J];药学学报;1992年07期
12 闫世凤,王小兵,赵桂森;海洋抗癌活性物质的研究进展[J];国外医学.药学分册;2005年04期
13 邹玺;刘宝瑞;钱晓萍;禹立霞;;土鳖虫提取液对人胃低分化腺癌细胞BGC-823的抑制作用[J];时珍国医国药;2006年09期
14 马中良;刘迎;黎晶晶;王旻;;粘细菌So ce cpu-1的鉴定及其抗肿瘤活性研究[J];生物技术;2006年06期
15 胡春梅;吴久鸿;;番荔枝科植物之黄酮类化合物及其生物活性研究进展[J];中国中药杂志;2007年09期
16 曲中原;邹翔;崔兰;胡国军;季宇彬;;青龙衣不同萃取部位抗肿瘤活性研究[J];上海中医药杂志;2009年01期
17 叶盛开;陈丽;刘宇鹏;刘丽娟;;OD-PTD融合蛋白对K562细胞的作用[J];临床军医杂志;2008年04期
18 司福亭;李靖靖;曾超;司方博;周晓莉;;熊果酸的抗肿瘤活性及作用机理研究进展[J];化学与生物工程;2010年01期
19 张奇,项光亚,龙娜,林佳亮,曾凡波;叶酸靶向的PGA联合N-苯乙酰化阿霉素的抗肿瘤活性[J];药学学报;2005年11期
20 雷瑶;王志洁;邱国福;胡先明;;大黄素脂质体对Hep-2细胞毒的检测[J];武汉大学学报(理学版);2006年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 郑艳波;甄永苏;;CD13靶向肽与力达霉素强化融合蛋白的制备及其抗肿瘤活性[A];2007医学前沿论坛暨第十届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2007年
2 崔向丽;赵志刚;苗庆芳;张胜华;甄永苏;;抗HER2单链抗体与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性研究[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年
3 崔向丽;李英;张胜华;甄永苏;;抗HER2单链抗体与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性研究[A];2007医学前沿论坛暨第十届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2007年
4 盛唯瑾;苗庆芳;商悦;甄永苏;;抗EGFR单链抗体与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性研究[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年
5 李勇;吕海宁;吴先富;徐嵩;庾石山;;黑龙骨抗肿瘤活性化学成分研究[A];第七届全国天然有机化学学术研讨会论文集[C];2008年
6 郑艳波;李毅;尚伯杨;吴淑英;甄永苏;;NGR肽与力达霉素强化融合蛋白的制备及抗肿瘤活性[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年
7 苗庆芳;尚伯杨;甄永苏;;单抗3G11的重链可变区单域抗体与力达霉素构建的基因 工程强化融合蛋白及其抗肿瘤活性研究[A];第三届中国肿瘤学术大会教育论文集[C];2004年
8 李琪;梁燕;张晶晶;冯利杰;王海萍;沈玉先;;tau蛋白的直接细胞毒作用[A];2007年全国药物毒理学会议论文集[C];2007年
9 王玉梅;刘畅;蒙冲;郭风云;;HEV ORF_2重组菌菌种的稳定性及融合蛋白的应用[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展(上册)[C];2001年
10 陈金顶;廖明;辛朝安;;鹅Ⅰ型禽副粘病毒株融合蛋白(F)基因的克隆及序列分析[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郑艳波;基于靶向肽的强化融合蛋白和化学偶联物的制备与抗肿瘤作用研究[D];中国协和医科大学;2007年
2 陈红霞;表皮生长因子受体配体寡肽与力达霉素组成的基因工程强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性的研究[D];中国协和医科大学;2005年
3 苗庆芳;抗Ⅳ型胶原酶单域抗体与力达霉素构建的基因工程强化融合蛋白及其抗肿瘤活性研究[D];中国协和医科大学;2004年
4 李忠东;力达霉素和博安霉素抗肿瘤活性的生物调节[D];中国协和医科大学;2002年
5 蒋骅;GST-EGFR融合蛋白冲击树突状细胞治疗头颈部鳞状细胞癌体内外实验观察[D];浙江大学;2008年
6 邵荣光;含烯二炔发色团新抗癌抗生素C1027的分子构成与抗肿瘤活性关系及其新型导向药物研究[D];中国协和医科大学;1995年
7 王慧芳;吨酮衍生物金属配合物的合成、表征以及与DNA相互作用的研究[D];兰州大学;2009年
8 谭明雄;中药白花丹活性成分白花丹素金属配合物的合成、抗肿瘤活性及与DNA作用研究[D];中南大学;2008年
9 刘红椿;桔霉素三聚体Tricitrinol B的抗肿瘤活性及机制研究[D];中国海洋大学;2009年
10 李亮;抗Ⅳ型胶原酶单抗scFv片段与力达霉素构建的基因工程强化融合蛋白及其抗肿瘤作用的研究[D];中国协和医科大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 林燕芳;姜黄素前体药物FM0806的体内外稳定性及其抗肿瘤活性研究[D];福建医科大学;2009年
2 葛菁;薯蓣皂苷抗肿瘤作用体内体外研究[D];吉林大学;2009年
3 左予桐;云南重楼抗肿瘤活性成分研究[D];天津大学;2005年
4 黄丹虹;天然产物D5、S3及其衍生物抗肿瘤活性的初步研究[D];厦门大学;2008年
5 朱莉;5-氟尿苷棕榈酸酯脂质体的制备及其细胞毒性研究[D];重庆医科大学;2008年
6 邵赞华;抗肿瘤活性真菌和放线菌的分离、筛选及其鉴定[D];福建农林大学;2011年
7 陈喆;幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和细胞空泡毒素基因的克隆,表达和其融合蛋白免疫反应性的研究[D];浙江大学;2002年
8 韩雪松;应用m_2 AchR-Gilα融合蛋白鉴别m_2 AchR的特异性配体[D];中国医科大学;2004年
9 万一;人TNF-α自体疫苗的研究[D];第四军医大学;2004年
10 席晓蓉;HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其免疫原性研究[D];昆明医学院;2005年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 田红 记者 胥茜;论文无创新 一票能否决[N];中国教育报;2005年
2 王握文周珞晶 吴丹;11篇全国优秀博士学位论文的启示[N];科技日报;2008年
3 记者 欧阳春艳;全国百篇优秀博士学位论文评选揭晓[N];长江日报;2005年
4 本报特约通讯员  汤宏;播撒创新的种子[N];解放军报;2006年
5 学位办;研究生院奖励优秀博士学位论文[N];中国社会科学院院报;2008年
6 徐宜军;哈工大博士学位论文实行匿名评议制度[N];新华每日电讯;2005年
7 周玲玲;2007年全国优秀博士学位论文评选结果公布[N];中国教育报;2007年
8 王曼;充分利用院图书馆特色文献信息资源[N];中国社会科学院院报;2005年
9 李大庆;中科院为今年留院博士启动研究工作[N];科技日报;2006年
10 记者 王坤宁;国图馆藏博士学位论文陆续结集[N];中国新闻出版报;2007年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978