皮肤微透析分析方法的构建及外用制剂体内经皮吸收的药代动力学研究

【摘要】： 目的系统或局部用药后，药物对靶点的药效作用主要取决于药物浓度和药物与受体之间的亲和力。其中药物与受体之间的亲和力由药物的结构和理化性质决定，因此靶组织的药物浓度是调节药物药效作用的主要手段。皮肤病皮损的治疗可以通过系统用药或局部用药进行，但针对皮损局部靶组织发挥药理作用的两种途径的药物需要了解靶皮损内的药物浓度，一如作用于皮肤病的系统发病环节靶点需要了解血药浓度一样。因而皮内药物浓度不仅是皮损局部药效作用重要的定量指标，而且是进行皮肤药代动力学研究的关键参数。以往的研究受研究方法和分析设备所限，很难准确测定局部用药后的皮内药物浓度。针对上述情况，我们首先建立小猪体内皮肤微透析(Microdialysis，MD)取样技术的动物模型，并对MD技术中的影响因素进行考察；与传统组织匀浆法相比较，评价MD方法用于监测皮内药物浓度的实用性及替代性；同时实时监测皮内药物浓度，对药效作用作定量分析；并利用皮肤药动学对制剂间生物等效性的应用进行探索；联合体外实验，观察药物的体、内外浓度—效应(毒性)关系，使新药研究及临床用药研究水平提升到一个新的高度。 方法选用小猪作为微透析模型，用高效液相色谱法(HPLC)测定相关样品中的待测物浓度，并对HPLC条件进行方法学考核。Ⅰ：以雷公藤内酯醇(T_0)为实验被检对象，在小猪为体内实施MD取样方法，建立模型，并考察实验的影响因素；Ⅱ：以MD方法连续、动态测定为基础，比较局部使用EMLA和P-L软膏两种主药相同、基质成分不同的低共熔局部麻醉制剂后的皮内实时药物浓度，评价MD技术在临床前处方筛选和优化研究中的应用前景；Ⅲ：通过体外细胞培养细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)法体外测定药物的细胞毒性、MD方法监测局部用药后皮内药物浓度、组织匀浆法测定局部用药后皮肤组织药物浓度、动物连续局部用药21天后皮肤组织病理学检查等步骤，观察药物细胞毒作用的体内、体外相关性和区别；Ⅳ：用体外溶出度实验分别测定三种生产商不同，但主药、浓度和剂型都相同的制剂的体外释放量，再用MD方法监测三种制剂的体内药物经皮吸收量，观察药物体外释放和体内经皮吸收对皮内浓度的影响，进而评价制剂间的生物等效性；Ⅴ：通过观察制剂的体外药物释放、体内经皮吸收和皮肤组织药物浓度测定，考察MD方法的局限性。 结果Ⅰ：在微透析方法的众多影响因素中，探针的灌流速度对实验结果影响最大，探针的相对回收率与灌流速度之间存在反指数关系；回收率和温度之间呈线性正相关；在实验浓度范围内，探针回收率与周围溶液浓度无相关性；对实验样品雷公藤内酯醇而言，不同的回收率测定方法所得结果之间无显著性差异；Ⅱ：外用实验制剂P-L软膏后两主成分利多卡因和丙胺卡因的经皮吸收总量(以AUC_(0-6)为评价指标)分别为EMLA的2.32和2.29倍，而皮内药物达峰浓度(C_(max))分别为EMLA的2.77和2.64倍。外用EMLA后皮内利多卡因和丙胺卡因的浓度分别在2.55h和2.47h达峰，而外用P-L软膏后1h左右皮内药物浓度即可以达到上述水平；Ⅲ：体外细胞培养实验中用CPE法测得化合物HB-13对人角质形成细胞HaCaT株的TC_(50)为24.03μg／mL；用微透析法测定0.5％HB-13凝胶经皮吸收后的皮内药物浓度的结果表明局部用药后皮内稳态药物浓度约为2.30μg／mL；匀浆法测得皮肤组织内的药物浓度平均为26.3μg／mL。在此前提下，延长给药时间至21天后观察给药部位皮肤的组织学变化的结果表明用药部位皮肤组织学无病理改变；Ⅳ：浓度和剂型相同的三种阿昔洛韦(acyclovir，ACV)乳膏的体外释放过程均符合Higuchi动力学方程，累积释放量Q与时间的平方根t~(1/2)拟合的线性最好，其中ACV乳膏2的体外释放量最高，为856.96±56.9μg／cm~2，ACV乳膏1次之，为833.22±42.76μg／cm~2，ACV乳膏3最低，为637.98±71.86μg／cm~2；上述三种ACV乳膏外用于局部皮肤后，ACV乳膏1的体内经皮吸收量最高，ACV乳膏2和ACV乳膏3的体内经皮吸收量之间无明显差异。用ACV乳膏2和3的药代动力学参数进行生物等效性评价，结果表明二者生物等效；Ⅴ：以醋酸曲安奈德(triamcinolone acetonide，TAA)为实验药的体外实验中，微透析探针对TAA的回收率较低，且与传递率不相等(平均值分别为13.97％和36.03％)。实验所用两种TAA制剂的药物体外释放和局部用药后皮肤组织药物浓度之间无明显差异，用MD方法在透析液中不能检测到TAA的药物浓度。 结论在建立MD方法的动物模型完成并对实验条件进行优化以后，可以用MD方法连续、微创、实时监测局部用药后的皮内药物浓度变化过程。在此基础上，可用直接的皮内药物浓度—时间数据计算外用制剂的局部药代动力学参数，进而进行制剂间生物等效性评价。MD方法在外用制剂的局部药代动力学研究、临床前处方筛选与优化、药物皮肤毒理浓度探索和外用制剂间生物等效性评价方面有良好的应用前景。但是，和所有的实验方法一样，MD方法也有方法学本身的局限性。探针对一部分脂溶性高、药物蛋白结合率高和分子量大的药物的回收率很低，造成透析液中药物浓度无法检测；另一方面，当探针对药物的回收率和传递率不一致时，经皮微透析实验中就无法对探针的体内回收率进行准确校正，只能观察到皮内药物浓度的变化趋势，而不能准确测定出皮内药物浓度。因此，在用MD方法进行药物体内经皮吸收研究中需要谨慎选择，以求得到的结果准确可靠。

【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R96