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《中国协和医科大学》 2007年
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BRAF~(V600E)突变基因对人黑素瘤细胞生长和侵袭能力的影响体内外研究

陈浩  
【摘要】: 皮肤恶性黑素瘤是恶性程度较高的肿瘤之一,易于侵袭和转移。近年来发现,BRAF基因在人黑素瘤中存在高频率的突变,目前对其在黑素瘤形成、侵袭和转移中的作用尚不完全明确。本课题的目的是通过质粒介导的RNA干扰技术来研究BRAF突变基因在黑素瘤发展、侵袭和转移中的作用。 首先,用脂质体转染试剂将3条构建并鉴定好的质粒载体(braf1、braf2和neg,其中braf1和braf2分别特异性针对人黑素瘤BRAF~(V600E)突变基因和BRAF基因,neg为阴性对照)转入黑素瘤细胞系A375细胞,并用含G418的培养液筛选阳性克隆。然后采用半定量RT-PCR和Westernblotting检测shRNA对BRAF基因的抑制作用。发现两个特异性质粒不同程度抑制BRAF基因的mRNA和蛋白的表达,其中以braf1的干扰效果最为明显,蛋白表达量下降90%。 第二,我们将等量转入质粒(braf1和neg)及未转入质粒的肿瘤细胞,分别注入裸鼠皮下,观察干扰BRAF~(V600E)后,肿瘤细胞的成瘤情况,结果显示braf1质粒组肿瘤较其它组生长缓慢,瘤体重量较轻。在另一个动物实验中,我们将质粒和转染试剂直接注射到动物模型的瘤体内,观察干扰BRAF~(V600E)基因对肿瘤生长的抑制情况。结果显示braf1质粒在一定时间内能抑制肿瘤生长,抑瘤率为62%。 第三,我们同样用半定量RT-PCR和Westernblotting检测了瘤体内的BRAF基因的表达,发现braf1质粒抑制了BRAF基因的mRNA和蛋白的表达,其中蛋白表达量下降62%。 第四,我们用半定量RT-PCR和Westernblotting检测了体内外肿瘤细胞BRAF突变基因被干扰前后,MMP-2和VEGF的表达,并用酶谱法测定了MMP-2的活性,结果显示MMP-2和VEGF的表达在体内外有不同程度的减少,其中体外降低程度较体内明显。 最后,我们用裸鼠和Transwell小室分别构建体内外的肿瘤侵袭模型,检测BRAF~(V600E)突变基因在肿瘤侵袭中的作用,结果发现braf1质粒组肿瘤细胞穿过metrigel的数目减少,其在体内形成的肺转移灶也是减少的。 以上结果说明,BRAF~(V600E)突变基因可以促进人黑素瘤细胞生长和增殖,可以使肿瘤细胞分泌更多的MMPs和VEGF,增强肿瘤细胞侵袭和血管形成的能力,提高其转移的能力,提示BRAF~(V600E)突变在黑素瘤生长、侵袭和转移中有重要作用,而以其为靶点的基因治疗可以抑制实验性黑素瘤的生长。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R739.5

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