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《中国协和医科大学》 2007年
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扩张型心肌病致病基因LMNA突变功能研究及心脏特异基因TNNI3K调控机制研究

王虎  
【摘要】: 扩张型心肌病是一种以左室或双心室的扩张和心肌收缩功能损害为特点的心肌疾病,最终可导致进行性难治性的心衰,是心脏移植的主要适应征之一,且常伴发室性心律失常,猝死率高,5年内病死率15%~50%。在美国应用该病晚期的诊断标准进行人群扩张型心肌病流行病学调查发现该病患病率为36.5/10万。扩张型心肌病患者中有50%左右是特发性的,这其中又有25%~50%的患者有家族遗传倾向,其遗传方式绝大多数为常染色体显性遗传。目前已确定的扩张型心肌病的致病基因中LMNA基因突变是导致扩张型心肌病的重要因素。Lamin A/C(LMNA)基因不同位点的突变和缺失可导致11种疾病,这些疾病被统称为核纤层病(laminopathies),其中包括扩张型心肌病在内的绝大多数疾病属于神经肌肉组织病变,少数与脂代谢和生物体的早衰相关。 我们收集了1个包含76名成员的中国人扩张型心肌病的家系(采集50名成员血样),用基因测序的方法对LMNA基因的12个外显子进行基因突变筛查,在8名成员中发现该基因的1号外显子第244位碱基位置发生G→A转换,其编码氨基酸由谷氨酸(E)变为赖氨酸(K),这其中3名成员被确诊为扩张型心肌病,1名成员表现为心脏扩张,这4名成员年龄均大于30岁,另外携带突变的4名成员年龄均小于30岁,暂未发现心脏扩张的临床症状。到目前为止,LMNA突变基因的致扩张型心肌病的机制仍然不清楚,为了初步探索该基因的致病机理,我们体外构建了该基因的Glu82Lys突变体,并转染HEK293细胞,实验结果显示,Glu82Lys突变改变了Lamin A/C蛋白及其相互作用蛋白emerin在细胞核膜的正常定位,由原来的主要分布于细胞核膜改变为弥散分布于整个核区以及细胞质中。突变蛋白的表达使得细胞核膜的正常结构被破坏,细胞核膜变得脆弱易碎。同时染色质异质化程度增加,染色质凝集异常。在过氧化氢诱导刺激下,LMNA基因Glu82Lys突变增加细胞凋亡发生率。 心脏是胚胎发育过程中第一个形成及发挥功能的器官,许多研究已经证明心脏特异基因对于心脏的发育、成熟以及功能的维持具有重要作用。TNNl3interacting kinase(TNNI3K)基因(又称CARK基因)是我们实验室克隆的高度特异表达在心脏组织中的新基因,研究显示其可能在心血管系统中发挥重要作用并有可能与心肌肥厚过程密切相关。基因的组织特异性表达通常是由于其调控因子表达的时间和空间的特异性所决定的。研究心脏发育(heart development)中心脏特异基因的遗传调控和转录网络可以帮助揭示心肌细胞分化和趋异过程中的分子机制,促使我们更深入地了解心脏发生(cardiogenesis)中出现的复杂而精确的转录调控程序。 我们通过寻找与人类CARK基因同源的小鼠EST序列并通过序列拼接克隆了小鼠CARK基因的mRNA序列并验证其表达谱,结果发现小鼠CARK基因的mRNA存在两种剪接体,表达谱显示CARK基因在小鼠心脏组织中高度特异表达。5’-RACE实验确定了小鼠CARK基因的转录起始位点(TSS)并通过调控区删节实验和双荧光素酶报告实验确定其核心启动子区位于+79bp至-151bp区域(以转录起始位点为+1)且其转录活性仅存在于心肌细胞中。通过物种间序列同源性比对,将保守的CARK基因核心启动子区序列提交CardioSignal数据库并搜索心脏特异的转录因子结合位点,结果发现Tbx5,SRE,M-CAT box,MEF2和GATA4五种调控元件在物种间高度保守。转录因子结合位点突变分析发现MEF2突变后CARK基因转录活性降低约99%,凝胶迁移及超迁移实验显示mef2c蛋白可以与MEF2位点结合,反义核酸干扰实验降低mef2c的表达量后,CARK基因的转录活性也随之降低,表明MEF2是调节CARK基因表达的最为关键的调控元件。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R542.2

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