应用脂肪干细胞与脱细胞真皮构建组织工程皮肤

【摘要】： 皮肤软组织缺损是整形外科和烧伤外科经常遇到的问题，临床上通常采用自体皮肤或异体皮肤移植进行修复。然而，这一治疗过程存在着缺乏充足的自体皮源，供区继发性损伤大，异体皮肤移植引发免疫排斥反应等等众多缺点。近二十年来，随着细胞生物学和分子生物学的迅猛发展、高新技术的应用以及学科间的相互渗透，创伤修复与组织再生从基础研究到临床应用都获得了迅猛发展。各国学者相继探索了许多种组织工程皮肤的构建方法，从根本上为临床解决皮肤缺损的修复提供了崭新的思路。但是，目前很多组织工程皮肤产品仍不成熟，存在着皮肤耐磨性差、自体种子细胞来源缺乏、异体种子细胞诱发免疫排斥反应、培养耗时长、治疗费用昂贵等缺点。因此，有必要探索一种具有良好临床应用前景的组织工程皮肤构建方法。 研究目的 探索脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)向表皮细胞定向分化的诱导培养方法，分析ADSCs诱导分化的表皮细胞是否具有干细胞的特性。 观察人脱细胞真皮的超微结构特点，分析其做为组织工程皮肤支架材料的合理性。探索应用ADSCs源类表皮干细胞复合脱细胞真皮体外构建组织工程皮肤的方法，观察该组织工程皮肤的组织结构特点与超微结构特点。 应用构建的组织工程皮肤修复实验动物皮肤缺损，观察治疗效果与成活后的组织结构特点和超微结构特点。 研究方法 1、采用贴壁分离方法从脂肪抽吸液中分离出脂肪干细胞，培养扩增。在表皮细胞诱导培养基中诱导ADSCs向表皮细胞定向分化。分别检测诱导前、后细胞的表面抗原表型，细胞周期与CK5、CK10、CK19表达情况，并绘制细胞增殖曲线。在成骨细胞诱导培养基中进一步诱导ADSCs源表皮细胞向成骨细胞定向分化，对诱导后的细胞进行ALP染色和Yon Kossa染色检查。 2、扫描电镜下观察人脱细胞真皮的超微结构。应用人ADSCs源类表皮干细胞复合人脱细胞真皮体外构建组织工程皮肤，对其进行组织学观察与超微结构观察。 3、应用组织工程皮肤和脱细胞真皮修复裸鼠皮肤缺损，术后观察皮肤缺损修复情况，对移植成活的组织工程皮肤进行基底膜糖原(PAS)染色检查和组织学观察，对DAPI标记的人ADSCs源类表皮干细胞进行示踪观察。 4、应用实验猪自体ADSCs源类表皮干细胞复合猪脱细胞真皮构建组织工程皮肤，修复其背部正中线左侧皮肤缺损。以猪脱细胞真皮修复右侧皮肤缺损做为对照。术后观察皮肤缺损修复情况，对移植成活的组织工程皮肤进行组织学观察和超微结构观察。 研究结果 1、ADSCs向表皮细胞诱导分化，72小时后部分细胞由梭形变成圆形或椭圆形，7天后大部分细胞呈圆形或椭圆形，排列成铺路石状。诱导培养前、后的细胞增殖曲线均呈S型，但是诱导培养前ADSCs 7d时增殖达到顶峰，诱导培养后的细胞6d时增殖达到顶峰。诱导培养前87.42％的细胞处于G_0和G_1期，诱导培养后96.38％的细胞处于G_0和G_1期。诱导培养后，少数细胞CK5免疫荧光染色呈阳性，部分细胞CK19免疫荧光染色呈阳性，CK19在mRNA水平的表达呈阳性。诱导培养后传代10次的细胞CK10、CK19在mRNA水平的表达呈阳性。诱导培养后传代10次的细胞形态无明显改变，X-Gal染色呈阴性，细胞染色体数目2n=46，核型为女性正常核型(46，xx)。裸鼠皮下注射诱导培养后传代10次的细胞，2个月后无瘤体形成。ADSCs源表皮细胞向成骨细胞诱导分化后，ALP染色和Yon Kossa染色显示为阳性。 2、人脱细胞真皮基底膜面与真皮面均为多孔结构，基底膜孔隙直径为31.03～82.76um(51.72±15.64um)，真皮孔隙直径为115.38～192.31um(143.27±23.95um)。对体外培养3天的组织工程皮肤进行扫描电镜观察，可见大量人ADSCs源类表皮干细胞粘附于脱细胞真皮基底膜上，细胞呈圆形、椭圆形，直径为75.62～107.86um(87.11±11.46um)，显著小于脱细胞真皮基底膜孔隙直径。组织学观察发现，体外培养2周的组织工程皮肤与正常皮肤的组织结构特征相似，仅缺少角质层。 3、术后1个月，实验组裸鼠背部移植的组织工程皮肤成活良好，但表皮较薄弱，色泽与周围正常皮肤相似。PAS染色可见表皮层和真皮层之间有呈深红染色、呈波浪状连续存在的基底膜。术后2个月，光镜下可见组织工程皮肤的结构与正常皮肤相似，真皮内无表皮样囊肿。应用DAPI标记人ADSCs源类表皮干细胞进行示踪观察，术后1个月可见表皮深层有2～3层较强荧光显色的细胞，术后2个月可见表皮深层有5～6层较弱荧光显色的细胞。对照组裸鼠术后1个月时背部创面未愈合，仍覆盖薄层痂皮，创缘轻度收缩。 4、术后1个月，实验猪背部正中线左侧移植的组织王程皮肤成活良好，表皮角化明显，色素缺失；正中线右侧移植的猪脱细胞真皮形成肉芽组织，局部结痂，创缘收缩明显。组织学观察可见，实验侧组织工程皮肤的结构与正常皮肤相似，真皮内无表皮样囊肿，表皮层与真皮层之间可见呈犬牙交错样相接的表皮突和真皮乳头；对照侧猪脱细胞真皮则转化为肉芽组织，其表面无表皮层覆盖。超微结构观察可见，在成活的组织工程皮肤基底膜与基底层细胞之间有半桥粒连接形成；表皮细胞的胞质中有角蛋白丝，成束状排列：相邻的表皮细胞之间形成桥粒连接。 研究结论 1、ADSCs具有易于获取，能够在体外大规模培养和扩增，性质稳定，多潜能分化，培养扩增不需要大量的血清等优点，是组织工程研究中良好的种子细胞来源。 2、ADSCs在体外诱导培养体系中能够向表皮细胞分化，部分细胞具备了表皮干细胞的一些特征，我们将其暂时命名为“ADSCs源类表皮干细胞”。ADSCs源类表皮干细胞在实验动物体内能够复层生长，形成表皮样结构。 3、本研究中，诱导ADSCs向表皮细胞分化的体外诱导培养体系具有安全性。 4、脱细胞真皮基底膜具有良好的细胞粘附性。基底膜与真皮均为多孔结构，基底膜和真皮的孔隙直径接近于支架材料促进表皮组织和真皮组织再生的最佳孔隙直径。 5、脱细胞真皮的结构特点有利于移植部位周围的成纤维细胞和血管内皮细胞移行进入并增殖，体外构建组织工程皮肤时不需在真皮层内复合成纤维细胞。这既降低了构建组织工程皮肤的复杂性和经济成本，同时还提高了安全性。 6、本研究中构建的组织工程皮肤具有生物活性，移植于实验动物体内后能够转化为组织结构合理的皮肤组织，未观察到表皮样囊肿形成。 7、本研究中构建的组织工程皮肤性状稳定，可以有效地修复实验动物皮肤缺损，具有良好的临床应用前景。

【关键词】：脂肪干细胞 诱导分化 脱细胞真皮 组织工程皮肤 皮肤缺损
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R318.0
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