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脐带干细胞的分离、鉴定及分化为心肌和内皮细胞的实验研究

武开宏  
【摘要】: 心血管疾病严重威胁人类的健康,细胞移植或体外构建组织工程移植物将是一个很有前景的治疗选择。但组织工程移植物面临再血管化或内皮化的问题,最近研究发现干细胞在体外可以分化为心肌和内皮细胞,对细胞移植和构建组织工程移植物有非常重要的意义。骨髓间充质干细胞是研究最多的干细胞,但是随着年龄的增加,骨髓间充质干细胞的数量和体外增殖分化能力都明显减弱,这需要我们去寻找更好的干细胞来源,脐带组织是非常有希望的干细胞替代来源。 本研究的第一部分采用胶原酶消化法从脐带组织中分离干细胞,新鲜分离的脐带细胞在培养72h后,开始贴壁,5天后贴壁细胞开始增多,形成细胞克隆,传代培养,细胞逐渐纯化,形态呈均一的细长梭形。流式细胞仪分析这些细胞表达CD13,CD29,CD44,CD90,CD166和MHC-Ⅰ,而不表达造血和内皮细胞的标志物,如CD31、CD34、CD38、CD45、CD106、CD117,CD144和MHC-Ⅱ,经多次传代后,表面分子表达无明显改变。在成骨细胞和成脂肪细胞诱导培养后,VonKossa染色和油红O染色阳性,说明其能够分化为骨细胞和脂肪细胞。这说明我们分离的脐带细胞与骨髓间充质干细胞具有相似的特性,证明了其干细胞特性,我们称之为UCDS细胞。 在第二部分中,我们研究了在5-氮胞苷的作用下,UCDS细胞能否分化为心肌样细胞。5-氮胞苷诱导后,细胞的形态不断发生变化,但是没有观察到明显的肌管形成,也没有观察到可以跳动的心肌细胞。RT-PCR检测显示分化后的UCDS细胞表达心肌特异性基因肌钙蛋白T,免疫组化检测诱导后的细胞表达心肌特异性α-肌动蛋白、肌球蛋白和肌钙蛋白T,表达率在50%以上。电镜下观察,诱导4周后,UCDS细胞有明显的肌丝样结构形成,说明在5-氮胞苷的作用下,UCDS细胞能够分化为心肌样细胞。 第三部分的目的是研究在内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的作用下,UCDS细胞能否向内皮细胞方向分化。在体外经过诱导之后,细胞形态不断发生变化,形成网格样结构。免疫荧光显示,分化后的UCDS细胞CD31、CD34染色阳性,具有摄取DiI-Ac-LDL的功能。流式鉴定细胞的分化效率可以达到50%左右。下肢缺血动物模型也证明,UCDS细胞能够在体内缺血环境下分化为内皮细胞,并且参与血管新生,改善下肢缺血状况。我们的研究结果表明UCDS细胞是非常有应用前景的干细胞来源,为心肌细胞移植和体外构建组织工程移植物以及移植物再血管化研究提供了新的种子细胞选择。


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