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《中国协和医科大学》 2007年 博士论文
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胰腺癌进展与血管生成因子表达及调控的相关研究

闫长青  
【摘要】: 研究背景及目的: 胰腺癌恶性度高,发展快、发现晚、预后差,占恶性肿瘤死亡率中第4位,平均生存时间为6-9个月,总5年生存率不足1%,胰腺癌治疗以综合治疗为主。手术切除率低、放化疗耐受是胰腺癌治疗效果不满意的主要原因。寻找新的安全有效的治疗手段是亟待解决的问题。血管形成是肿瘤生长、侵袭及转移的基础,抗肿瘤新生血管形成的研究已经发展成为目前抗肿瘤治疗当中最具潜力的一个研究热点。抗血管形成治疗在抑制肿瘤生长进展的基础上结合放、化疗可能会获得理想的协同治疗效果。为了进一步探讨抗血管形成治疗在胰腺癌治疗中的作用,有必要对胰腺癌发生及进展过程中血管形成调控作用及机理进行深入了解。血管生成因子是调节肿瘤及正常机体血管形成最重要的因素,因此通过对胰腺癌进展过程中血管生成因子表达的研究可能为进一步了解胰腺癌发生及进展机制及提高胰腺癌诊断和综合治疗水平提供新的思路。 肿瘤新生血管生成调控是肿瘤细胞和宿主相互作用的结果,血管生成因子主要来源于肿瘤细胞、宿主细胞及细胞外基质。血管生成因子不仅调节肿瘤新生血管形成,而且对肿瘤细胞增殖、侵袭等生物学特性产生影响,参与胰腺癌进展全过程,血管生成因子的表达与肿瘤的恶性程度、浸润转移及预后密切相关。人体内新生血管调控因子按其功能可以分为两类:促血管生成因子和抑血管生成因子。为了全面系统地了解血管生成因子在胰腺癌进展中的作用和意义,首先,我们拟通过检测胰腺癌病人外周血清中血管生成因子表达的变化,即血管生成因子在机体的综合表达情况,研究其在胰腺癌进展中的作用及临床意义;进一步,通过对多株胰腺癌细胞血管生成因子表达水平差异与胰腺癌细胞株的恶性生物学表现,如生长、增殖及侵袭进行对比研究,以期在细胞水平探讨血管生成因子与癌细胞恶性行为的关系,为评估抗血管形成治疗及提出治疗策略提供有力的理论和实验依据。具体工作分为两部分: 第一部分胰腺癌病人外周血血管生成因子表达水平变化与疾病进展关系的研究:通过酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)检测胰腺癌病人、胰腺炎病人及正常人外周血血清中血管生成因子浓度,对照临床诊治资料进行分析。结果显示:促/抑血管生成因子在胰腺癌病人外周血高中表达,胰腺癌病人中不能手术切除组较手术切除组VEGF、angiostatin及endostatin表达显著升高,胰腺癌病人术后一周VEGF及IFG-1表达升高,TSP-1、angiostatin及endostatin显著降低。VEGF与肿瘤分化、淋巴转移、血管侵犯、远处转移及临床分期密切相关,bFGF与肿瘤分化及肿瘤大小密切相关,IGF-1与血管侵犯密切相关,endostatin与肿瘤大小密切相关,angiostatin与肿瘤大小及血管侵犯密切相关,TSP-1与血管侵犯及远处转移密切相关。VEGF表达与endostatin表达显著相关,bFGF表达与endostatin及angiostatin表达显著相关,endostatin表达与angiostatin表达显著相关。 第二部分胰腺癌细胞株血管生成因子表达水平与其细胞生物学特性的相关研究:通过逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chainreaction RT-PCR)及ELISA检测多株胰腺癌细胞及培养上清液中血管生成因子表达水平,同时通过CCK-8及Boyden Chamber趋化小室法进行胰腺癌细胞株sw1990、Capan-1、Aspc-1,MiaPaCa-2,Panc-1及PCT-3的增殖及侵袭性检测。结果显示:VEGF在6株细胞中均有表达,各株表达量存在显著差异,以侵袭性最强的Panc-1表达最强。bFGF在6株细胞中均有表达,各组表达量亦存在显著差异,增殖及侵袭性较强的Panc-1和PCT-3中的表达也强于其他细胞株。RT-PCR实验结果显示6株胰腺癌细胞株均无IGF-Ⅰ表达。6株胰腺癌细胞TSP-1表达差异显著,总体表达水平较低。6株胰腺癌细胞endostatin表达差异显著,在侵袭性最强的Panc-1中表达最强,其他细胞株不表达或表达量很低。血管生成因子在同一胰腺癌细胞株存在共表达。胰腺癌细胞株胞外的VEGF及endostatin表达显著强于胞内表达,bFGF胞内表达显著强于胞外表达。 通过siRNA技术干预胰腺癌细胞株sw1990、Panc-1及PCT-3的VEGF和bFGF的表达,CCK-8及Boyden Chamber趋化小室法观察胰腺癌细胞增殖及侵袭性变化。结果显示:抑制VEGF和bFGF表达,sw1990、Panc-1及PCT-3侵袭性减弱,sw1990增殖显著抑制,PCT-3增殖趋势受抑,Panc-1与对照组无差异;同时抑制VEGF及bFGF表达与单独抑制VEGF及bFGF表达相比较,在不同细胞株对增殖及侵袭性影响不尽相同。 通过siRNA技术干预胰腺癌细胞株sw1990、Panc-1及PCT-3的VEGF和bFGF的表达,RT-PCR及ELISA观察血管生成因子VEGF、bFGF及endostatin表达变化。结果显示:通过VEGFsiRNA能够显著抑制VEGF表达,同时sw1990、Panc-1及PCT-3三株胰腺癌细胞株bFGF在mRNA水平及细胞外分泌水平表达均升高,sw1990及Panc-1显著升高。通过bFGFsiRNA能够显著抑制bFGF表达,同时VEGF在sw1990、Pane-1及PCT-3在mRNA水平及细胞外分泌水平降低,PCT-3及Panc-1在mRNA水平降低显著,sw1990及PCT-3在细胞外分泌水平降低显著。抑制VEGF或bFGF表达,三株细胞endostatin mRNA在不同处理组表达无显著变化,sw1990及PCT-3 endostatin在细胞外分泌水平表达显著降低,Panc-1无显著变化。 通过我们的研究可以得出以下结论: 1.血管生成因子表达与胰腺癌进展密切相关,对临床病人外周血血管生成因子的检测能够为胰腺癌诊断、鉴别诊断、手术可切除性判断及预后估计提供有力依据。 2.胰腺癌细胞在血管生成因子表达调控中发挥重要作用,在参与调节肿瘤局部血管生成同时可能通过血管生成因子的活化及表达调节在癌细胞恶性增殖及侵袭过程中发挥重要的调节作用。血管生成因子表达水平可能与胰腺癌细胞生物学特性密切相关。 3.胰腺癌细胞株增殖及侵袭性与VEGF及bFGF表达关系密切,通过siRNA能够抑制胰腺癌细胞VEGF及bFGF表达,同时能够显著抑制肿瘤增殖并下调胰腺癌细胞侵袭性。VEGF和bFGF可能成为胰腺癌抗血管治疗的理想靶标,同时抑制VEGF及bFGF对特定细胞株增殖或侵袭性的影响具有协同作用。 4.siRNA技术能够显著抑制相应血管生成因子的表达。胰腺癌细胞内VEGF与bFGF的表达调控之间,VEGF和bFGF表达与抑血管生成因子endostatin表达调控之间存在复杂的相互调节作用。VEGF及bFGF表达之间的调节可能发生在转录水平,VEGF及bFGF表达变化对于endostatin表达的调节作用可能发生在转录水平以后,对胶原蛋白ⅩⅧ水解的调节可能是其主要机制。


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