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《中国协和医科大学》 2007年
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人白细胞介素15 cDNA协同优化的人乳头瘤病毒16型E7核酸疫苗治疗宫颈癌的初步研究

赵欣  
【摘要】: 宫颈癌是妇女因恶性肿瘤而死亡的第二位死因,是威胁妇女健康的大敌。高危型人乳头瘤病毒(HPV),尤其是HPV 16型是宫颈癌的主要致病因子,99%以上的宫颈癌病例都可检测到HPV感染。晚期宫颈癌的治疗除了手术放化疗以外尚无良策。那么针对宫颈癌的病因——HPV感染来研制预防和治疗宫颈癌的疫苗来战胜宫颈癌已成为人们的普遍共识,并已取得了一定成果。其中治疗性疫苗多选用HPV的两个早期基因E6和E7基因作为抗原基因。这两个基因的表达产物是引起细胞恶性转化的主要癌蛋白。疫苗的形式多种多样,包括微生物载体疫苗,蛋白疫苗,DNA疫苗等。大多数疫苗在动物实验中都取得了较好的抗瘤效果,部分已进入临床实验。但目前得到的临床实验的结果并不尽如人意。所以提高治疗性疫苗的免疫原性从而增强疫苗的免疫效果十分必要。 本研究是关于宫颈癌治疗性疫苗的研究。研究选用了DNA疫苗这一形式,采用HPV16 E7基因作为抗原靶基因,从增强疫苗免疫原性并消除抗原蛋白转化活性这一角度出发,对抗原基因进行了一系列优化,并将优化后的基因与结核分枝杆菌热休克蛋白70(MtHSP70)基因相融合作为宫颈癌治疗性疫苗的主体,为了增强免疫效果,还选用人白细胞介素15(hIL-15)基因作为分子佐剂协同免疫。研究首先构建了一系列重组真核表达质粒,使用Western blot,免疫荧光以及ELISA方法验证了这些质粒的体外表达后,对动物进行了分组免疫,并对该疫苗激发机体产生免疫反应的可能机制进行了探讨。具体的疫苗优化策略和实验结果如下: 1.对HPV16 E7基因进行系列优化。首先对E7基因进行gene shuffle,即基因切割重排。将E7基因分成a,b,c三个部分,将中间部分b重复一次,得到abbc序列,并在该序列的两端各添加一个HLA*A0201表位,得到重排的HPV16 E7基因(ShE7)。基因重排后,用哺乳动物偏爱的密码子对HPV16 ShE7病毒基因进行优化,并突变了与转化活性相关的Rb位点和锌指结合区,期望通过这样的优化策略来提高表位剂量,增加蛋白表达量并消除抗原蛋白的转化活性。基因优化后,采用人工合成的方法合成了HPV16 E7基因。 2.选用VR1012作为疫苗的真核表达载体,将优化的HPV16 ShE7与MtHSP70基因相融合,构建了以HPV16 ShE7/MtHSP70融合基因为主体的DNA疫苗VR1012-HPV16 ShE7/MtHSP70,同时构建了野生型HPV16 E7基因,单独HPV16 ShE7基因和MtHSP70基因的真核表达质粒—VR1012-WE7,VR1012-SHE7,VR1012-MtHSP70。另外还构建了两个人IL-15的真核表达质粒—VR1012-hIL-15和VR1012-hIL-2S/hI1-15。将上述重组质粒分别瞬时转染COS-7细胞,通过Western blot和免疫荧光的方法鉴定了WE7,ShE7,ShE7/MtHSP70以及Mt HSP70蛋白在细胞中的表达与定位,通过ELISA的方法鉴定了IL-15在细胞中的分泌性表达。 3.选用PGEX-4T1作为原核表达载体,构建了HPV16 E7基因的原核表达载体,在E.Coli(BL21/DE3)中表达了GST-E7融合蛋白并使用亲和层析的方法对该蛋白进行了纯化。该蛋白拟用于检测疫苗免疫后产生的特异性E7抗体,根据凝胶薄层扫描结果显示,蛋白纯度达到75%以上,可以满足体外免疫检测实验的要求。 4.用上述构建的真核表达质粒对小鼠进行了免疫。 将6-8周龄C57BL/6小鼠随机分为六组:WE7免疫组,ShE7免疫组,ShE7/MtHSP70免疫组,ShE7/MtHSP70+hIL-15免疫组,hIL-15免疫组和空载体VR1012对照组。双侧股四头肌注射接种三次,肌肉注射后进行体内电穿孔以增强基因转染效率。在WE7免疫组内增加2只小鼠未进行体内电穿孔,用于比较体内电穿孔的效果。每次每种质粒接种100μg,间隔2周。 作为宫颈癌治疗性疫苗的研究,免疫原性的检测,体内抗瘤实验以及抗瘤免疫机制的深入研究十分必要。本研究所作的工作为后续进一步深入研究人IL-15协同HPV16 ShE7/MtHSP70核酸疫苗的免疫原性,体内抗瘤活性以及免疫机制奠定了基础。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R737.33

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【参考文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
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