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《中国协和医科大学》 2007年
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亚硒酸钠诱导人急性早幼粒白血病NB4细胞凋亡作用机制研究

韩兵社  
【摘要】: 已有的大量生物学和医学研究结果表明:微量元素硒将是抗肿瘤药物研究领域一个很有前途的研究热点。近年来已经有研究报道,多种硒化合物在高浓度时可以在体外刺激肿瘤细胞发生凋亡和生长阻滞,其具体机制随着细胞类型和硒化合物的种类不同而有明显的区别。我们的前期研究也表明,亚硒酸钠在较高浓度时(5-20μM无毒范为内),能够有效抑制人急性早幼粒白血病NB4细胞的生长增殖并诱发细胞凋亡,此作用在一定范围内呈浓度依赖性,其详细作用机制有待进一步研究。 在本文中,我们针对亚硒酸钠诱导人急性早幼粒白血病NB4细胞线粒体凋亡信号转导通路中Bcl—2家族成员的作用机制以及MAPK/Akt等上游蛋白激酶通路的作用机制进行了研究,并在我们的研究中取得以下结果。 在20μM亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中,伴随有NB4细胞线粒体膜电位的降低,细胞色素C由线粒体向细胞质的释放,应用caspase 9抑制剂z-LEHD-fmk可以有效抑制亚硒酸钠诱导的NB4细胞凋亡。进一步研究发现,在NB4细胞凋亡过程中,抗凋亡蛋白Bcl—xL含量下降,促凋亡蛋白Bax和Bak蛋白水平均显著上调,而且Bax在凋亡晚期可以被切割产生18kD的切割产物。提取细胞线粒体发现线粒体上的Bax,Bak含量随凋亡的进行而增加,发生了线粒体转位,DSS交联实验发现Bax发生了同源二聚化。应用RNA干扰技术下调NB4细胞中的Bax水平可以有效抑制凋亡的进行。Bad蛋白水平发生上调,而Bad的Ser 112和Ser 136的磷酸化修饰发生下调。Bid蛋白在凋亡晚期明显下调,但未发现明显的切割反应,caspase 8抑制剂z-IETD-fmk对亚硒酸钠诱发的凋亡影响不显著。同时还检测了Bcl-2 Ser 70的磷酸化水平的改变。以上结果说明,在亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的过程中,内源性线粒体凋亡信号转导通路发挥了重要的作用,Bcl-2家族成员Bax,Bak,Bad,Bcl—xL在此凋亡信号转导通路的调节中发挥有重要的作用。 在对MAPK家族中的主要成员(Erk,p38 MAPK,JNK)研究时发现,20μM亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中,Erk和JNK活性随亚硒酸钠诱导时间的增加而逐渐降低,而p38 MAPK的活性则由24小时起显著升高。同时发现Erk信号通路几种上下游信号分子活性同时改变:MEK活性下调,p90 RSK活性下调,Raf Ser 338磷酸化水平下调,证明在亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中Erk信号通路的整体下调,说明此通路起着重要作用。进一步应用特异性抑制剂PD98059,SB203580,SP600125预处理NB4细胞后发现,MEK抑制剂PD98059可以有效抑制亚硒酸钠诱导的NB4凋亡,Erk激活剂TPA则可以促进NB4细胞凋亡。而p38 MAPK抑制剂SB203580和JNK抑制剂SP600125对亚硒酸钠诱导的NB4细胞凋亡没有显著影响。进一步研究发现,MEK抑制剂PD98059对亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的影响和其加入的顺序有关,仅在亚硒酸钠处理NB4细胞以前加入PD98059会对NB4凋亡产生抑制作用,在此后加入的PD98059反而促进亚硒酸钠诱导的NB4细胞凋亡。上述结果表明在亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的过程中,Erk发挥了重要的调节作用,其活性在凋亡早期是促进凋亡的,而在晚期是抑制凋亡的;本研究所设定的实验条件下,p38 MAPK和JNK对亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的调节作用并不明显,其对亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的长期效应有待进一步研究。 在对Akt的研究中发现,20μM亚硒酸钠处理NB4细胞可以引发Akt活性的迅速下调,其变化明显早于上述三种MAPK的变化。同时发现其上游信号激酶PDK1和下游底物Raf Ser 259磷酸化、Bad Ser 136和GSK-3βSer 9磷酸化水平均迅速发生下调,证明了在亚硒酸钠诱发NB4细胞凋亡中Akt信号通路的整体下调,同时还发现发现Akt信号通路中重要上游负调控蛋白PTEN Ser380的磷酸化水平下降。应用PI3K特异性抑制剂LY294002进行研究发现,单独使用LY294002作用NB4细胞就可以诱发NB4细胞发生凋亡,作用呈现剂量依赖性;同时LY 294002可以加强亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的作用。应用LY 294002抑制Akt活性可以下调Erk活性及Bad Ser 112磷酸化水平,同时显著上调p38 MAPK和JNK活性,显示了NB4细胞中不同激酶信号通路之间的交叉作用。根据上述结果可以推断:Akt活性是人急性早幼粒白血病细胞株NB4细胞的存活所必需的,Akt活性下调将诱发NB4细胞走向细胞凋亡;Akt活性下调是亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的过程中的一个非常重要的早期事件,Akt活性的下调随后诱发了下游众多凋亡事件,包括Erk活性下调,Bad Ser 112和Ser 136去磷酸化,p38 MAPK激活等一系列事件,最终诱发细胞凋亡。 同时,我们还研究了Akt和Erk,p38 MAPK,JNK在不同浓度亚硒酸钠作用NB4细胞中可能发挥的作用。结果显示:在低浓度(5μM以下)的亚硒酸钠作用下,Erk和Akt的活性都发生了上调,在高浓度(10μM以上)时亚硒酸钠可以以浓度依赖的方式抑制Akt和Erk的活性;亚硒酸钠可以以浓度依赖的方式上调p38MAPK的活性,在20,40μM作用尤其显著:高浓度的亚硒酸钠可以抑制JNK的活性。结合现有文献表明上述激酶的这些变化可能与亚硒酸钠不同浓度时的不同生物学效应有关。上述研究结果对于深入了解亚硒酸钠诱导白血病细胞的凋亡机制给出了重要的实验结果,具有重要的科学意义。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R733.71

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