RanBPM和TRAF6相互作用及其功能的研究

【摘要】： 神经营养素能够影响脊椎动物神经元的增殖、分化、凋亡、存活等生命过程，但其功能的发挥则需要Trk和p75NTR两种膜受体的存在。RanBPM(Ran binding protein in microtubule organizing center)是Trk和p75NTR的下游信号分子，开始是作为Ran的结合蛋白而发现的，并参与微管的成核现象而命名，是一种广泛表达而又高度保守的蛋白，其分子量为90kDa。已有研究证实RanBPM可以与多种蛋白相互作用，其中包括跨膜蛋白和细胞内信号分子。这些相互作用的蛋白主要包括受体Met、整合素LFA-1、种系特异性的RNA解旋酶、鼠脉管同源蛋白Mvh(mouse vasa homolog protein)周期蛋白依赖性激酶11(CDK11或P46)、神经营养素受体p75NTR、人精子膜蛋白、Calbindin D28K、Twal、PDGB(porphobilinnogen deaminase、USP11、p73、Raf、酪氨酸激酶受体Axl和Sky、神经营养素受体TrkA等等。 TRAF6是多种生理过程的信号调节分子，先天性和获得性免疫、骨代谢、淋巴结发育、乳腺发育甚至皮肤和中枢神经系统的发育无不与TRAF6密不可分。作为接头分子，TRAF6在七种已发现的的TRAFs蛋白中显得极为特殊，是唯一直接参与TNFR和IL-1R／TLR两个超家族信号传导的TRAF信号分子。因此TRAF6是阻断多发性骨髓瘤增值和存活的重要分子。文献报道以及我们前期的工作表明TrkA和p75NTR都与RanBPM和TRAF6在信号通路上相关联。在信号通路中，往往许多通路相互交叉而形成网络影响细胞的新陈代谢、生长分化。基于上述考虑，我们认为RanBPM和TRAF6可能有相互的作用，并且有其特定的功能： 1、利用生物学分析软件，我们得知RanBPM与TRAF6可以相互作用，作用位点在RanBPM的SPRY结构域内； 2、通过酵母双杂体系、过表达免疫共沉淀和内源性免疫共沉淀方法证明了RanBPM能够与TRAF6相互作用。 3、通过用NF kappa B作为报告基因证明了RanBPM可以降低TRAF6引起的NF kappa B通路的信号的传导。 4、利用细胞计数方法检测了共同转染RanBPM和TRAF6时可以提高细胞的增殖。 5、确定了RanBPM与TRAF6相互作用的区域是RanBPM的SPRY区。 6、用NGF刺激MCF7，发现TRAF6和RanBPM的相互结合的量增加。 7、TRAF6参与了TrkA、RanBPM、p75和Snapin免疫复合物的形成。 本实验室以前的用酵母双杂交体系、过表达免疫共沉淀和荧光共振能量转移(FRET)证明了TrkA、p75可以分别与RanBPM可以相互作用，现在在本论文中用MCF7、MD-MDA-231和293T细胞证明了内源性TrkA、p75可以分别与RanBPM可以在体内相互作用。 ARBP(Apoptosis Related Basic Protein)是许多细胞中存在的参与细胞凋亡的蛋白；Snapin是本实验室以ARBP为诱饵蛋白通过酵母双杂交而获得的捕获蛋白，此蛋白是参与神经突触信号传递的重要辅助蛋白。我们在大肠杆菌中表达并纯化了ARBP和Snapin的融合蛋白，并利用新西兰大白兔制备了他们的抗体。这为以后研究这两种蛋白提供了有力的工具。 根据本实验室以前的研究成果，我们已经确定ARBP和Snapin在酵母双杂交体系中有相互的作用，这可以用在三缺的SD板上生长和X-gal变蓝来证实他们的相互作用。因此我们在293T细胞中转染了pCMV-ARBP和pCMV-Snapin表达载体，我们确定ARBP可以抑制Snapin的表达。在此基础上，我们又发现ARBP可以提高真核翻译起始因子4A(eIF4A)的表达。 TrkA与已有研究报道能够与Snapin相互作用并激活下游的信号通路的肝细胞生长因子的受体MET相比具有37％的同源性，我们又通过实验对参与神经递质释放的蛋白Snapin和TrkA进行了研究，结果发现： 在酵母体双杂体系中TrkAICD、TrkA-ATP、TrkA-775、TrkA-790均能够与Snapin相互作用。 通过以上的研究，我们为神经细胞中信号的传导提供了新资料，为更好的研究神经信号的传导中TrkA与p75NTR受体的功能以及接头分子RanBPM和TRAF6提供了有益的线索，为神经细胞中信号的传导网络的作用机制的阐明提供了有用的证据；并且为更深入的研究神经递质的释放以及NGF的影响下引起细胞凋亡或分化的信号通路和机制打下了基础。