一、PPARγ激动剂罗格列酮及GLP02的抗肿瘤作用及机制研究 二、hPPARγ2质粒的构建和高表达细胞模型的建立及生物学功能探讨 三、hPPARγ2单克隆抗体的制备

【摘要】： 过氧化酶体激活物增殖受体(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)属于配体激活的转录因子，目前已发现三种亚型：PPARα、PPARγ和PPARδ。PPARγ在脂肪组织中表达较高，在乳腺、结肠、肺、卵巢等其它组织中也有不同程度的表达。研究结果表明PPARγ激活后除了可促进脂肪形成及发挥抗炎作用外，还可抑制肿瘤细胞的增殖、诱导其分化并促进凋亡、对其侵袭转移也有一定的抑制作用。 噻唑烷二酮类(thiazolidinediones，TZDs)是一类具有强烈PPARγ激动活性的化合物，其中以罗格列酮(Rosiglitazone，ROZ)的活性最强，可达纳摩尔水平。GLP02则为一新合成的化合物，也属于PPARγ激动剂，由我所合成室郭宗儒教授课题组提供。在该部分研究中，将主要探讨ROZ和GLP02对结肠癌、乳腺癌和黑色素瘤细胞株的抗肿瘤作用及相关机制。 1．对人结肠癌HT-29细胞的抗肿瘤作用 ROZ和GLP02均可明显抑制HT-29细胞的生长及集落形成，后者的抑制作用明显强于前者。两者均可抑制HT-29细胞DNA和蛋白质的合成，对后者的抑制尤为显著。 ROZ和GLP02可减少G1期细胞比例，而增加G_2期和S期细胞的比例。HT-29细胞经两化合物处理72h后可出现明显的DNA梯状条带(DNA Ladder)，ROZ处理细胞后，凋亡细胞所占比例明显升高，Western Blot结果显示，ROZ和GLP02可明显降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。 RT-PCR、Western Blot和免疫组化的结果显示，ROZ可促进HT-29细胞PPARγ的表达，并呈剂量依赖性；GLP02在低剂量时即可明显提高PPARγ的表达，而增加剂量后反而抑制其表达。 ROZ不影响ERK1／2的表达，但可以明显促进p-ERK的表达，推测ROZ可能是通过促进ERK磷酸化而增加PPARγ磷酸化水平，从而导致PPARγ活性降低，影响细胞增殖并诱导凋亡。与ROZ不同，GLP02可明显降低ERK1／2和p-ERK的表达，推测该化合物可能是通过抑制ERK1／2及其磷酸化，而发挥抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用。 与体外研究结果一致，裸鼠实验结果显示ROZ和GLP02均可使肿瘤组织发生明显纤维化，抑制裸鼠HT-29异体移植瘤的生长，GLP02的抑制效果强于ROZ。 相关研究报道显示PPARγ和类视黄醇X受体(retinoid X receptor，RXR)两者只有在组成异二聚体同时活化时才能充分发挥作用，其中任一受体单独激活都不足以完全抑制肿瘤细胞的增殖。故本研究将PPARγ激动剂ROZ与RXR激动剂全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)同时应用，观察后者是否可增强ROZ对HT-29细胞的抑制作用，以期为结肠癌的治疗提供实验依据。 2．ROZ和ATRA联合应用在人结肠癌HT-29的抗肿瘤作用 两者联合应用的结果显示，ATRA可明显增强ROZ对HT-29的生长抑制作用，提高其诱导细胞凋亡的能力。在两者单独使用均不引起细胞凋亡的剂量下联合使用，可使HT-29细胞的凋亡比例达到37.9％和60.6％。单独使用ATRA对Bcl-2的表达无影响，ROZ则可降低Bcl-2的表达，并呈剂量依赖性，两者联合应用后降低HT-29细胞Bcl-2表达的作用显著增强。 ROZ和ATRA单独应用时仅轻微升高HT-29细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)的活性，而联合使用对AKP活性的影响明显增强。提示两者联合使用可促进HT-29细胞的分化。 HT-29细胞分别经ROZ和ATRA单独作用以及两者联合作用后接种于裸鼠体内，ATRA单独作用后形成的肿瘤其大小与对照组相比无明显差别，ROZ作用后形成的肿瘤体积约为对照组的一半，而两者联合处理后形成的肿瘤明显缩小，仅为对照组的10％左右。 ROZ和ATRA联合作用于HT-29细胞后，其G1期细胞降低的比例较单药更为明显，G2期细胞下降的比例也很明显，而S期的比例则呈上升趋势。 ROZ对ERK的表达没有明显影响，但联合应用ATRA后，ERK的表达明显增加，同时，ROZ还可增加ERK的磷酸化水平，联合应用ATRA后，p-ERK的表达在ROZ低剂量时升高，高剂量时抑制。 3．对乳腺癌的抗肿瘤作用 ROZ和GLP02对MCF-7细胞的生长均有明显地抑制作用，可抑制其DNA的合成，GLP02的作用强于ROZ。ROZ和GLP02可引起少部分细胞发生凋亡，对凋亡相关蛋白Bcl-2的表达也具有一定的降低作用，同样GLP02的作用略强于ROZ。 细胞周期分析结果显示，ROZ可以升高G1+G2期细胞比例，同时降低S期细胞的比例。GLP02对G1期细胞比例无明显影响，增加G2期+S期细胞的比例。 ROZ使MCF-7细胞中的PPARγ表达升高，而GLP02使其剂量依赖性地降低。 对蛋白P53的分析结果显示，ROZ和GLP02对P53的表达均有增强作用。 两化合物在低于诱导细胞凋亡的剂量下可诱导细胞成衰老样表型，维持细胞衰老状态。 体内裸鼠移植瘤实验结果与体外实验结果一致，ROZ可以明显抑制MCF-7裸鼠移植瘤的生长，作用强度与阿霉素相当，而且对裸鼠体重无明显影响。 4．对黑色素瘤的抗肿瘤作用 ROZ和GLP02对B16、B16BL6及A375黑色素瘤细胞均具有一定生长抑制作用，可降低其集落形成能力。 ROZ和GLP02可以使B16、B16BL6细胞形态发生明显地改变，而对A375细胞形态的影响不明显。两者均可使B16BL6和A375细胞内的黑色素及酪氨酸酶活性升高，提示ROZ和GLP02对黑色素瘤细胞具有一定的分化诱导作用。 ROZ和GLP02还可抑制A375细胞穿过人工基底膜，提示两者在体外具有抗侵袭转移活性。 流式细胞分析结果表明，ROZ可以使A375细胞阻滞在G1+G2期，S期细胞比例降低。GLP02作用后则增加S期细胞的比例，降低G1+G2期细胞的比例。 ROZ和GLP02在促进细胞分化的同时可以诱导其发生凋亡。在受试剂量下均出现明显的“DNA”梯状条带，使P53蛋白的表达升高，Bcl-2蛋白的表达显著降低。 RT-PCR、Western Blot的实验结果均显示，ROZ可以增高A375细胞中PPARγ的表达，GLP02在低剂量时可促进PPARγ的表达，剂量升高则抑制PPARγ的表达。 Western Blot结果表明，ROZ和GLP02对ERK的表达无明显影响，但可显著降低p-ERK的表达。推测两化合物可能通过抑制ERK磷酸化而抑制肿瘤的生长和促进分化。 与体外结果相一致，体内实验的结果显示GLP02可明显缩小A375移植瘤的瘤体积。 ROZ和GLP02还可抑制DNA拓扑异构酶I(topoisomerase I，Topo I)的松弛活性。 综上所述，ROZ和GLP02可能是通过诱导分化，促进凋亡以及抗侵袭转移等多种机制而发挥其抗肿瘤作用，该类化合物有望成为新型的抗肿瘤药物。 PPARγ与肿瘤的关系还未完全清楚阐明，存在着诸多矛盾的结论，究其原因可能是PPARγ作用范围广泛，作用机制复杂，影响PPARγ发挥作用的影响因素多，并且受PPARγ调控的靶基因多且复杂，相互之间亦存在交互作用。乳腺癌与PPARγ的表达尤为密切，因此在本研究中，为了比较PPARγ在正常细胞与肿瘤细胞之间、在乳腺癌细胞雌激素受体阳性和受体阴性细胞之间作用的联系与差异，初步探讨PPARγ基因在抗肿瘤作用中的功能及可能的信号传导途径，将hPPARγ2基因转染入NIH3T3、MCF-7、MDA-MB-231细胞，经过鉴定筛选出稳定高表达的转基因细胞株。 研究中发现转入hPPARγ2基因后，三株细胞中PPARγ的表达无论在mRNA水平还是在蛋白质水平均明显升高。对于未转入基因的细胞，ROZ均增高原有PPARγ的表达，对于转基因的细胞，ROZ同样升高NIH3T3细胞中PPARγ表达，而降低MDA-MB-231中PPARγ的表达，对于MCF-7细胞则是低剂量时增高，高剂量时抑制，而这也正与诱导分化的结果一致。 1．NIH3T3细胞与Pγ2-NIH3T3细胞 1．1转入hPPARγ2基因后，NIH3T3细胞形态发生了明显的改变，虽然细胞克隆形成能力没有明显差别，但形成的克隆较为紧密。MTT实验结果显示，转入hPPARγ2基因的细胞对PPARγ激动剂的敏感性略有增加。ROZ对Pγ2-NIH3T3细胞的克隆形成抑制作用显著强于NIH3T3细胞。 1．2转入hPPARγ2基因后，对NIH3T3细胞的细胞周期没有影响，转入前，ROZ使NIH3T3细胞阻滞在G1期，而G2期和S期的细胞比例明显降低，转入后细胞仍阻滞在G1期，但S期降低的程度比较显著，对G2期无明显影响。PPARγ基因可使NIH3T3细胞不易发生凋亡，P53的表达在转入基因后降低，ROZ对未转入基因细胞的P53表达无明显影响，而显著升高Pγ2-NIH3T3细胞P53的表达水平，与细胞凋亡的趋势近似一致。转入基因后的细胞P21略有升高，ROZ对其转染前后均有增高作用， 1．3了转入基因后对基底膜的粘附能力增加，分子水平上也观察到E-selectin表达在Pγ2-NIH3T3细胞中表达升高，而其它相关基因无明显影响。ROZ对NIH3T3细胞粘附略有减低作用，对Pγ2-NIH3T3细胞降低效果较为明显，对于NIH3T3细胞，ROZ仅降低β-cat的表达，而对于Pγ2-NIH3T3细胞，除降低β-cat的表达外，E-cadherin及E-selectin均降低。 1．4转入hPPARγ2基因可使细胞的运动能力增强，ROZ可以抑制转染后细胞的运动。 1．5 hPPARγ2基因对NIH3T3细胞的ERK及p-ERK表达无明显影响，ROZ对NIH3T3细胞仅升高ERK的表达，对p-ERK表达无影响，而对Py2-NIH3T3细胞却仅略升高ERK的表达，而显著降低ERK的磷酸化水平。 1．6 hPPARγ2基因使p-JNK的表达明显增高，也升高了JNK的表达。ROZ作用后仅升高NIH3T3细胞的JNK水平，而明显降低Py2-NIH3T3细胞的JNK和p-JNK的表达。 1．7 hPPARγ2基因使P38和P38激活形式的表达均有所降低，ROZ仅对NIH3T3细胞的P38表达略有降低，而对Pγ2-NIH3T3细胞却可以显著升高二者的表达。 1．8转入基因后NIH3T3细胞出现致瘤性。 2．MDA-MB-231细胞与Pγ2-MDA-MB-231细胞 2．1转入hPPARγ2基因后，细胞形态发生了明显的改变，克隆的形态也发生明显改变，形成的克隆较未转入基因的细胞为之松散，与细胞在转染后易于穿过基底膜而侵袭性增强的结果相一致。MTT实验结果显示，Pγ2-MDA-MB-231细胞对PPARγ激动剂的敏感性略有增加。ROZ对Pγ2-MDA-MB-231细胞的克隆形成抑制作用显著强于MDA-MB-231细胞。 2．2转入hPPARγ2基因后，G1期、G2期和S期细胞的比例无明显变化。对于MDA-MB-231细胞，ROZ使细胞阻滞在G2期，而G1期细胞比例降低，ROZ使Pγ2-MDA-MB-231细胞明显阻滞于G1期，而G2期，尤其是S期细胞比例显著降低。 2．3转入hPPARγ2基因使乳腺癌细胞凋亡比例略有升高。ROZ可使凋亡比例有不程度的增加。转入基因后Bcl-2的表达升高，bax的表达降低，ROZ对MDA-MB-231细胞无明显影响，而使Pγ2-MDA-MB-231细胞中Bcl-2的表达降低，bax的表达升高。 2．4转入目的基因后，P16表达略有升高，ROZ对转染前后P16表达均有升高作用。cyclinE变化不明显，ROZ对转染前后cyclinE表达均呈抑制作用。 2．5转入目的基因后，细胞的粘附能力下降，ROZ对MDA-MB-231细胞的粘附能力有抑制作用，对Pγ2-MDA-MB-231细胞的作用不明显。 2．6 hPPARγ2略微升高细胞β-cat的表达，对ICAM的表达影响不明显。ROZ对MDA-MB-231细胞中上述基因的表达无明显作用，但可降低Pγ2-MDA-MB-231细胞中上述基因的表达。 2．7转入hPPARγ2基因后细胞穿过人工基底膜的能力增强，且ROZ对转染前后细胞穿过膜的能力均有一定抑制作用，对转染后细胞的抑制作用更强。 2．8 hPPARγ2基因对于MDA-MB-231细胞中MAPK信号传导通路除了对ERK略有降低作用外，对于其它均有升高作用，尤其是对JNK的磷酸化形式增高的更为明显。ROZ作用后对MDA-MB-231细胞中JNK和P38途径基本无影响，仅轻微降低JNK的水平。对ERK的表达略有降低，同时升高ERK的磷酸化形式，对于Pγ2-MDA-MB-231细胞，ROZ除了可以升高ERK的表达外，对于其它的表达均降低，尤其是对JNK和p-JNK表达的降低作用更为显著。 2．9 MDA-MB-231细胞中有一定的BRCA1表达，而转入PPARγ基因后，BRCA1的表达明显降低到基本不表达。 2．10在MDA-MB-231细胞中，hPPARγ2基因对TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3的mRNA表达无明显影响，ROZ可以升高转染前后细胞中TGFβ1的水平，ROZ对MDA-MB-231细胞中TGFβ2及TGFβ3的表达无明显作用，但可以降低Pγ2-MDA-MB-231细胞中的表达。hPPARγ2基因对TGFβRⅠ的表达无影响，升高TGFβRⅡ和p-TGFβRⅡ的表达，ROZ可使转染前后的TGFβRⅠ表达升高，使转染前的TGFβRⅡ和p-TGFβRⅡ表达均增高，而使转染后的TGFβRⅡ和p-TGFβRⅡ表达均降低。 2．11转入hPPARγ2基因后，细胞IGF1R的表达增高，ROZ对转染前后细胞IGF1R表达均呈抑制作用。hPPARγ2基因对MDA-MB-231中IGFBP3表达无影响，但ROZ可以使转染前后细胞中的表达均降低。 2．12转入目的基因后，MDA-MB-231细胞中的COX-2表达升高，ROZ对转染前后细胞中COX-2的表达均有降低作用。目的基因不引起TopoI表达的变化，但ROZ降低转染前后细胞中TopoI的表达。 2．13转入基因后细胞的致瘤性增强。 3．MCF-7细胞与Pγ2-MCF-7细胞 3．1转入hPPARγ2基因后，细胞形态发生了明显地改变，克隆形态也发生明显地改变，MCF-7细胞形成的克隆较转染前为之松散，与细胞在转染后易于穿过基底膜而侵袭性增强的结果相一致。MTT实验结果显示，Pγ2-MCF-7细胞对PPARγ激动剂的敏感性略有增加。ROZ对Pγ2-MCF-7细胞的克隆形成抑制作用显著强于未转入基因的细胞。 3．2将目的基因转入细胞后，G1期细胞比例略有升高，同时S期细胞的比例略有下降。对于转染前后的细胞，ROZ均使细胞明显阻滞于G1期和G2期，而S期细胞比例显著降低。 3．3转入目的基因后，使细胞凋亡比例略有升高。ROZ均可使凋亡比例呈不程度地增加。 3．4转入目的基因后，P53表达略有升高，ROZ对MCF-7细胞中P53表达无影响，而显著升高Pγ2-MCF-7细胞中P53表达。转入基因后Bcl-2的表达无变化，而bax的表达降低。ROZ对两者的表达无明显影响，而升高Pγ2-MCF-7细胞中Bcl-2的表达，降低bax的表达。 3．5 MCF-7细胞易发生分化，ROZ作用后细胞的分化程度明显提高。而转入PPARγ基因后，细胞的分化能力降低，ROZ在低剂量下可促进其分化，而高剂量反而抑制。 3．6转入基因后细胞穿过基底膜的能力增强，ROZ对Pγ2-MCF-7细胞穿膜能力呈抑制作用。 3．7转入基因后细胞的粘附性降低，ROZ可降低转染前后细胞对Martrigel的粘附性。E-cadherin、β-cat的表达无变化。ROZ可明显降低Pγ2-MCF-7细胞中β-cat的表达。β_2-mg在转入PPARγ2基因前后表达均无明显变化，ROZ对MCF-7的细胞无影响，但可使Pγ2-MCF-7细胞中的表达降低。转入基因后，integrinα2的表达升高，ROZ对MCF-7细胞中其表达无影响，但降低Pγ2-MCF-7细胞中integrinα2的表达。 3．8转入hPPARγ2基因后，p-ERK，JNK，p-P38表达均升高，p-JNK降低。ROZ作用后，降低MCF-7细胞中p-ERK，JNK，p-JNK，P38的表达，同时也降低Pγ2-MCF-7细胞中JNK，p-JNK，p-P38的表达。 3．9 hPPARγ2基因对TGFβ2，TGFβ3的mRNA表达无明显影响，对MCF-7细胞中二者的表达无影响，仅降低Pγ2-MCF-7细胞中TGFβ3的表达。hPPARγ2基因可升高TGFβRⅠ、TGFβRⅡ和p-TGFβRⅡ的表达，ROZ可使转染前后的TGFβRⅠ表达升高，但对MCF-7细胞的TGFβRⅡ和p-TGFβRⅡ表达无影响，而使Pγ2-MCF-7细胞的TGFβRⅡ和p-TGFβRⅡ表达降低。 3．10转入hPPARγ2基因的Pγ2-MCF-7细胞中EGF表达无变化，而EGFR水平升高，ROZ对转染前后细胞中EGF的表达均有降低作用，但仅能使Pγ2-MCF-7细胞中EGFR的水平降低。 3．11研究中发现转入hPPARγ2基因后，无论从mRNA水平还是在蛋白质水平，MCF-7细胞中ERα的表达均显著降低，ROZ对MCF-7细胞中ERα表达无影响，但继续降低Pγ2-MCF-7细胞中ERα的表达。 3．12转入hPPARγ2基因后对MCF-7细胞中COX-2的表达无影响，ROZ对Pγ2-MCF-7细胞中的COX-2表达呈降低作用。 综上所述，转入hPPARγ2基因后可使细胞形态改变，致瘤性增强、细胞粘附能力降低，运动功能增强，肿瘤细胞分化能力降低、侵袭转移能力增加，而且hPPARγ2主要影响MAPK通路、一些生长因子的通路(如TGFβ、IGF1、EGFR)以及激素水平和周期凋亡相关的蛋白，反过来，MAPK及其它生长因子及激素也影响hPPARγ2的表达。因此可以认为hPPARγ2基因有可能成为肿瘤治疗和诊断的一个靶点，而其激动剂有望成为治疗肿瘤或者辅助治疗肿瘤的一类新药。 首先，利用论文第二部分建立的pMD18-T／hPPARγ2亚克隆扩增出hPPAR~／2前1017bp cDNA。利用pET原核表达系统表达了含有hPPARγ2前339个氨基酸(C-Histag)融合蛋白，并成功地进行了纯化。 其次利用原核表达的重组hPPARγ2蛋白制备了特异性抗hPPARγ2单克隆抗体184，3H2，3H10，10D6和10D8。通过ELISA和Western Blot方法对抗体进行了特异性鉴定。证明这5株单抗均为hPPARγ2的特异性抗体。 综上所述，这些系统的建立和鼠源抗hPPARγ2单克隆抗体的制备为后续的针对hPPARγ2抗肿瘤作用及机制研究提供了良好的工具，同时为细胞水平高通量筛选模型的建立奠定了基础，节约了成本。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R96
【目录】：