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《中国协和医科大学》 2006年
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炎症因子加重脂质介导的肾脏损害及PPAR-γ激动剂的保护机制研究

刘华  
【摘要】: 多种肾脏疾病存在着脂代谢异常,高脂血症本身也参与了肾脏疾病的进展。越来越多的证据表明肾小球硬化与动脉粥样硬化有相似的病理改变和病理生理机制。以往的研究证明炎症和动脉粥样硬化有关,而各种肾脏疾病又往往存在着微炎症状态,因此有理由相信炎症因子与脂质是动脉粥样硬化和肾小球硬化的共同病因。 氧化低密度脂蛋白(0x-LDL)是动脉粥样硬化形成的重要危险因子,它通过与内皮细胞表面的植物血凝素样受体(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor,LOX-1)特异性结合,使内皮功能失调,参与动脉粥样硬化的形成。ATP结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)是ATP结合盒转运体(ABC)超家族的成员之一。ABCA1以ATP为能源促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出,在胆固醇逆转运(RCT)和高密度脂蛋白(HDL)生成的起始步骤中ABCA1起重要作用,事实上ABCA1可抑制动脉粥样硬化斑块的形成,具有抗早期动脉粥样硬化的功能。原发和继发性肾小球肾炎中的炎症反应是肾脏组织损伤的主要机制之一,已知炎症因子如TNF-α、IL-1β可以调节0x-LDL多种受体在内皮等细胞的表达,促进动脉粥样硬化的形成,然而在肾小球硬化中该炎症因子的病理生理机制尚不明确。本研究旨在揭示炎症因子IL-1β是否改变人肾小球系膜细胞株(HMCL)LOX-1、ABCA1受体的表达,进而影响细胞水平的胆固醇稳态;研究PPAR-γ激动剂在IL-1β存在情况下对LOX-1、ABCA1表达的影响,探讨影响受体表达和延缓肾小球疾病进展可能的干预措施。 方法: 1、脂质化学染色观察HMCL对0x-LDL的摄取,研究IL-1β对HMCL脂质摄取的影响。2、激光共聚焦显微镜和流式细胞计数检测HMCL对荧光Dil标记的0x-LDL(Dil-0x-LDL)的摄取,研究IL-1β和抗LOX-1抗体对脂质摄取的影响,分析LOX-1受体的功能及IL-1β影响脂质摄取的可能作用途径。3、Real-time PCR和Western Blot方法检测IL-1β对LOX-1、ABCA1表达的影响及PPAR-γ激动剂15d-PGJ_2的作用。 结果: 1、油红“0”染色发现HMCL摄取0x-LDL,5ng/ml IL-1β刺激24小时,HMCL摄取Ox-LDL较对照明显增加。 2、激光共聚焦检查发现IL-1β剂量和时间依赖性促进HMCL摄取Dil-0x-LDL。IL-1β2.5、5、10ng/ml分别刺激细胞24小时,10ng/ml组细胞内平均荧光值达到峰值(基础值的6.08倍);5ng/ml lL-1β刺激0、8、12、24小时,24小时组细胞内平均荧光值达到峰值(基础值的5.55倍)。 3、流式细胞仪计数发现IL-1β剂量和时间依赖性促进HMCL摄取Dil-0x-LDL。IL-1β2.5、5、10ng/ml分别刺激细胞24小时,10ng/ml组细胞内平均荧光值达到峰值(基础值的7.36倍);5ng/ml IL-1β刺激0、8、12、24小时,24小时组细胞内平均荧光值达到峰值(基础值的5.93倍)。事先应用抗LOX-1抗体共孵育2小时,IL-1β刺激组细胞内平均荧光值下调为89.8%。 4、体外培养的HMCL表达LOX-1 mRNA和蛋白,IL-1β剂量和时间依赖性促进LOX-1mRNA和蛋白的表达。IL-1β2.5、5、10ng/ml分别刺激细胞12小时,10ng/ml组细胞LOX-1 mRNA升高到峰值(基础值的6.57倍);IL-1β(5ng/ml)刺激细胞0-24小时,3小时细胞LOX-1mRNA开始升高(基础值的3.89倍),6小时达高峰(基础值的6.87倍),后逐渐下降,24小时细胞LOX-1mRNA仍较对照升高(基础值的2.58倍)。IL-1β2.5、5、10ng/ml分别刺激细胞24小时,10ng/ml组LOX-1蛋白达到峰值(基础值的2.57倍);IL-1β(5ng/ml)刺激细胞0-24小时,24小时达高峰(基础值的1.88倍)。 5、0x-LDL剂量和时间依赖性促进LOX-1mRNA和蛋白表达。0x-LDL 40μg/ml刺激细胞0-24小时,LOX-1mRNA于12小时达峰值(基础值的3.97倍),后逐渐下降,24小时和对照无差别。0x-LDL 10、20、40、60μg/ml分别作用于细胞12小时,40μg/ml组达到峰值(基础值的3.73倍)。IL-1β5ng/ml与0x-LDL共孵育,较40μg/ml单独刺激组表达升高(为对照5.16倍)。0x-LDL 40μg/ml刺激细胞0-24小时,LOX-1蛋白24小时达高峰(基础值的1.79倍)。0x-LDL 10、20、40、60μg/ml分别作用细胞24小时,40μg/ml组细胞LOX-1蛋白达到峰值(基础值的1.81倍)。IL-1β5ng/ml与40μg/ml0x-LDL共孵育,LOX-1蛋白较单独Ox-LDL刺激组表达升高(为对照2.28倍)。 6、HMCL在脂质负荷的情况(40μg/ml 0x-LDL预先孵育HMCL24小时),IL-1β呈剂量和时间依赖性降低HMCL ABCA1mRNA和蛋白表达。IL-1β2.5、5、10ng/ml分别刺激细胞12小时,10ng/ml组ABCA1mRNA下降最明显(为对照的14.16%);IL-1β(5ng/ml)刺激细胞0-48小时,48小时ABCA1mRNA下降最明显(为对照的19.0%)。IL-1β2.5、5、10ng/ml分别刺激细胞24小时,10ng/ml组ABCA1蛋白降为对照47.97%,IL~1β(5ng/ml)刺激细胞0-48小时,48小时降为对照50.62%。 7、15d-PGJ_2呈剂量依赖性抑制IL-1β诱导的LOX-1mRNA和蛋白表达。与单纯IL-1β(5ng/ml)刺激组相比,15d-PGJ_2浓度2.5,5,10μmol/L处理组细胞LOX-1mRNA表达分别下调为73.13%,66.54%,35.23%,15d-PGJ_2浓度5和10μmol/L处理组细胞LOX-1蛋白表达分别下调为82.39%和63.17%。 8、15d—PGJ_2呈剂量依赖性的增加IL-1β抑制的ABCA1mRNA和蛋白表达。与单纯IL-1β(5ng/ml)刺激组相比,15d-PGJ_2浓度2.5,5,10μmol/L的处理组细胞ABCA1mRNA表达分别升高为1.34、2.15、2.88倍,15d-PGJ_2浓度5和10μmol/L处理组细胞ABCA1蛋白质表达分别升高为1.16、1.54倍。 结论:本实验条件下 1、HMCL基础状态下摄取0x-LDL,炎症因子IL-1β促进HMCL对0x-LDL的摄取。 2、IL-1β促进Ox-LDL的特异性受体LOX-1mRNA及蛋白的表达,抗LOX-1抗体部分阻断IL-1β诱导的HMCL对0x-LDL摄取,说明IL-1β可能通过LOX-1途径增强对0x-LDL摄取。 3、0x-LDL在一定浓度(10μg/ml-40μg/ml)范围内剂量和时间依赖性促进HMCLLOX-1mRNA和蛋白表达;IL-1β与0x-LDL共孵育,可以增强0x-LDL促进HMCL对LOX-1表达。 4、IL-1β抑制脂质负荷情况下的HMCL ABCA1 mRNA及蛋白的表达。 5、15d-PGJ_2剂量依赖性抑制IL-1β诱导的LOX-1mRNA和蛋白表达,改善IL-1β对ABCA1mRNA和蛋白表达的抑制。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R692

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