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《中国协和医科大学》 2006年
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ppENK、S100A4及其甲基化在胰腺癌发病机制的研究

杨立新  
【摘要】: 胰腺癌的恶性程度高,预后差,其5年生存率只有5%,由于胰腺癌症状隐匿,发现症状时大部分已处于晚期,且手术切除率低,内科药物治疗效果不理想。胰腺癌的发病机理不详,这给早期诊断以及进一步治疗带来很大困难,只有真正揭示胰腺癌发病的内在机制,才能寻找到有效的诊断及治疗方法。 ppENK基因定位于8q23-24,含有四个外显子和三个内含子。作为神经肽介质基因,ppENK基因编码甲硫氨酸—脑啡肽,而甲硫氨酸—脑啡肽能够明显抑制胰腺癌的生长。S100A4基因最初来源于小鼠腺癌细胞株CSML100,其表达与肿瘤的转移潜能相关。S100A4基因属于S100家族,定位于染色体1q21,参与多种生物学行为,如肿瘤细胞的侵袭和转移等。 DNA甲基化是基因转录的重要调控因素,其在肿瘤发生中的作用是近年来的研究热点,DNA甲基化的改变涉及多种肿瘤,因此,改变DNA甲基化可以为人类治疗肿瘤提供新的途径。 本研究旨在探讨ppENK基因和S100A4基因甲基化与胰腺癌的相关性,并初步探讨去甲基化药物对胰腺癌细胞增殖及细胞周期、细胞凋亡等的影响。 第一部分:胰腺癌组织S100A4与ppENK基因表达及甲基化与胰腺癌相关的临床研究 以胰腺癌组织、正常胰腺组织为研究对象进行了以下研究: 1.采用MSP方法分析ppENK基因在31例胰腺癌组织及正常胰腺组织中的甲基化状态;2.免疫组化方法检测32例胰腺癌组织标本中S100A4蛋白表达阳性比率;3.采用COBRA方法分析S100A4基因(+331)位点在31例胰腺癌组织及正常胰腺组织中的甲基化状态;4.Fisher's Exact Test法比较:①ppENK基因与胰腺癌组织肿瘤分化程度、肿瘤大小、临床分期、肿瘤部位、性别、年龄、吸烟、饮酒等临床病理指标的相关性;②S100A4蛋白表达与胰腺癌组织肿瘤分化程度、肿瘤大小、临床分期、肿瘤部位、性别、年龄、吸烟、饮酒等临床病理指标的相关性;③(+331)位点低甲基化与S100A4蛋白表达的相关性,及与胰腺癌组织肿瘤分化程度、肿瘤大小、临床分期、肿瘤部位、性别、年龄、吸烟、饮酒等临床病理指标的相关性;④S100A4基因(+331)位点低甲基化与ppENK基因甲基化进行相关性分析。 研究结果显示: 1.在31例胰腺癌组织标本中,ppENK基因甲基化率为90.3%(28/31)而正常胰腺未表现甲基化,未发现ppENK基因甲基化与临床病理指标存在相关性;2.S100A4蛋白在胰腺癌组织中表达率为87.1%(27/32),在正常胰腺组织中不表达。S100A4蛋白的表达与肿瘤的分化程度有关。肿瘤分化程度越低,表达阳性率越高;3.S100A4基因(+331)位点低甲基化率为71.0%(22/31),在正常胰腺癌组织中呈高甲基化,(+331)位点低甲基化与外周血CA19-9水平呈相关性;4.(+331)位点低甲基化与S100A4蛋白表达呈相关性;5.S100A4基因(+331)位点低甲基化与ppENK基因甲基化呈相关性。 小结: 1与正常胰腺组织相比,ppENK基因在胰腺癌组织中存在较高的甲基化率(90.3%);2.S100A4蛋白在胰腺癌组织中存在较高比率的表达(87.1%),在正常胰腺组织中不表达。该基因(+331)位点与正常胰腺组织相比,在胰腺癌组织中表现为低甲基化,其比率为71.0%,低甲基化与S100A4蛋白表达有相关性;3.S100A4蛋白的表达与肿瘤的分化程度有关,肿瘤分化程度越低,表达阳性率越高;(+331)位点低甲基化与CA19-9水平呈相关性。而ppENK基因与临床病理指标无相关性;4.S100A4基因(+331)位点低甲基化与ppENK基因甲基化呈相关性。 第二部分:胰腺癌细胞株S100A4与ppENK基因表达及甲基化在胰腺癌发生发展中的作用 以5株胰腺癌细胞株(SW1990、Panc-1、PC3、Aspc-1、Pupan-1)和正常胰腺为研究对象进行了以下研究: 1.采用MSP方法分析5株胰腺癌细胞株ppENK基因甲基化状态,RT-PCR方法检测胰腺癌细胞株、正常胰腺组织ppENK基因mRNA表达;2.采用COBRA方法分析5株胰腺癌细胞株S100A4基因(+331)位点的甲基化状态;RT-PCR方法观察胰腺癌细胞株及正常胰腺组织S100A4基因mRNA的表达;3.采用MTT方法观察去甲基化药物5-aza-dC对胰腺癌细胞株(Panc-1、Aspc-1)细胞增殖的影响;4.PI染色经流式细胞仪检测去甲基化药物5-aza-dC对胰腺癌细胞株(Panc-1、Aspc-1)细胞凋亡、细胞周期的影响;5.MSP方法观察去甲基化药物5-aza-dC对Panc-1、Aspc-1细胞ppENK基因甲基化状态的影响,RT-PCR方法检测去甲基化药物5-aza-dC对Panc-1、Aspc-1细胞ppENK基因mRNA表达的影响。 研究结果显示: 1.ppENK基因在正常胰腺组织中表达,在5株胰腺癌细胞株中表达失活,但与正常胰腺组织相比,均表现甲基化;胰腺癌细胞株及正常胰腺ppENK基因表达与甲基化呈相关性;2.S100A4基因在正常胰腺组织中不表达,表现为高甲基化;在5株胰腺癌细胞株中表达,表现为低甲基化;胰腺癌细胞株及正常胰腺S100A4基因表达与低甲基化之间呈相关性;3.胰腺癌细胞株及正常胰腺ppENK基因甲基化与S100A4基因低甲基化之间呈相关性;4.MTT结果显示:5-aza-dC在0.6uM、0.8uM、1.0uM浓度下72h、96h、120h对Aspc-1、Panc-1细胞增殖均有不同程度抑制作用,其中Aspc-1细胞OD值以96小时1.0uM时最为显著(p<0.05),Panc-1细胞以120小时1.0uM时最为显著(p<0.05);5.Panc-1与Aspc-1予5-aza-dC 1uM后经PI染色,Panc-1细胞治疗组和对照组细胞凋亡百分率平均值分别为31.57±6.76%和3.21±1.43%(p<0.05);而Aspc-1细胞分别为16.6±8.22%和3.82±1.71%(p>0.05);6.流式细胞仪检测显示,Panc-1细胞的静止期(G1期)细胞百分率显著增加,DNA合成期(S期)细胞百分率显著降低(p<0.05),但Aspc-1细胞未出现明显的G1期停滞及S期减少(p>0.05);7.对Panc-1、Aspc-1予去甲基化药物5-aza-dC后可见ppENK基因表达,甲基化状态改变。 小结 1.ppENK基因正常胰腺组织中存在表达,在5株胰腺癌细胞株均无表达,5株胰腺癌细胞株ppENK基因均表现为甲基化,表达与甲基化呈相关性;2.S100A4基因在正常胰腺组织中不表达,在5株胰腺癌细胞株中均有表达,5株胰腺癌细胞株中,(+331)位点均表现为低甲基化,表达与低甲基化呈相关性;3.ppENK基因甲基化与S100A4基因低甲基化之间呈相关性;4.去甲基化药物可逆转ppENK基因表达、改变ppENK基因甲基化状态;应用去甲基化药物后可抑制胰腺癌细胞增殖,增加细胞凋亡和影响细胞周期。 结论: 从分子水平对胰腺癌组织与细胞株研究显示,甲基化引起的ppENK基因失活和S100A4基因激活是胰腺癌发生发展重要的环节,ppENK基因甲基化和S100A4低甲基化可能成为胰腺癌细胞区别正常胰腺细胞的分子事件,S100A4基因(+331)位点低甲基化与ppENK基因甲基化呈相关性。S100A4蛋白的表达与肿瘤的分化程度有关,S100A4基因(+331)位点低甲基化与CA19-9水平呈相关性;ppENK基因甲基化状态的改变,可能抑制胰腺癌的生长,增加凋亡并影响细胞周期。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R735.9

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