胰岛移植治疗糖尿病的临床前研究
【摘要】：
第一部分胰岛移植治疗糖尿病的临床前研究
糖尿病是对人类生命健康危害最为严重的疾病之一。胰岛移植是二十世纪七十年代建立的一种治疗糖尿病的技术方法,特别是本世纪采用Edmonton胰岛方案以来,胰岛移植已经发展成为一项成熟的技术,成为纠正糖代谢紊乱,防治并逆转糖尿病慢性并发症的有效方法。
目的建立人胰岛分离、纯化和功能评价的技术方案,并应用该方案对所分离和纯化的人胰岛进行体内、外功能的评价和安全性评估,为开展临床胰岛移植奠定基础,为并申报胰岛细胞治疗临床准入批文提供系统的数据资料。
方法获得成人尸体胰腺供体6例,采用胶原酶消化法及密度梯度离心法分离和纯化人尸体胰腺供体的胰岛,经双硫腙(DTZ)染色计数并分析胰岛细胞的纯度。通过AO/PI染色评价分离胰岛的活力;通过电子显微镜观察胰岛素分泌颗粒;采用免疫荧光染色分析分离胰岛的细胞组成和分布;通过RT-PCR检测分离胰岛主要激素和自身抗原mRNA的表达;通过静态葡萄糖刺激检测胰岛素分泌功能;将分离的人胰岛移植到糖尿病小鼠评价胰岛的代谢功能;并对分离胰岛的产品进行细菌污染,内毒素含量和凝血活性等安全性指标的检测。
结果成人尸体胰腺供体6例,冷缺血时间10-12个小时,胰腺重量65.61±19.31(41.30-94.87)g,未消化组织重量15.09±8.21(7.44-26.85)g,消化组织的重量为50.52±19.56(33.86-83.45)g;分离纯化后胰岛的数量为22.9±3.1万IEQs(4970±1620IEQs/g组织);经不连续密度梯度纯化后,胰岛的纯度为59.0%±8.9%(49%-70%);吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色显示,分离胰岛的活力为89%±3%(85%-94%);RT-PCR表明,分离胰岛的胰岛素、胰高糖素、IA2、IAR、ICAp69以及GAD65 mRNA表达阳性;静态葡萄糖孵育刺激胰岛素释放的刺激指数(SI)为8.1±4.0(3.8-10.2);透射电镜扫描可见分离的胰岛细胞中有大量的胰岛素分泌颗粒;冰冻切片的免疫荧光染色显示分离胰岛中C-肽(C-peptide)阳性细胞占大多数,主要分布于胰岛的中心部位,胰高糖素(glucagon)阳性细胞次之,主要分布在胰岛的周边部位,生长抑素(somatostatin)阳性细胞较少,主要散在分布于胰岛内,胰多肽(pancreaticpolytide)阳性细胞很少,主要分布于胰岛的周边;冻存复苏后的胰岛经AO/PI染色观察胰岛的活力为85%;冻存复苏后的胰岛经静态葡萄糖刺激后,胰岛素分泌的刺激指数为2.5;将分离纯化后的人胰岛移植于链脲菌素(STZ)制备糖尿病裸鼠的左肾包膜下,发现治疗组血糖3天后降至正常水平并长期保持;切除接受了胰岛移植的左侧肾脏后,糖尿病裸鼠的血糖明显升高;对分离胰岛的培养上清进行细菌培养的检测,结果为阴性,胰岛培养上清中内毒素含量＜0.5EU/ml,凝血活性＜300U/ml。这些结果和技术指标已经全面达到或超过美国迈阿密胰岛移植中心和宾夕法尼亚胰岛移植中心的技术指标。
结论采用我们制定的胰岛分离、纯化技术方案所分离的人胰岛在形态、结构、数量、纯度、活力、体内外功能以及安全性等方面的各项指标都达到实施临床胰岛移植的标准,为最终开展临床胰岛移植奠定了临床前基础.
第二部分胰腺干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的实验研究
糖尿病是危害人类健康的慢性疾病,近年来发病率不断增加,糖尿病导致的各种严重并发症是患者致死、致残的主要原因。胰岛素治疗不能有效逆转糖尿病微血管并发症,胰岛移植是糖尿病的有效治疗手段。然而,胰腺供体的缺乏限制了胰岛移植的广泛开展。干细胞具有体外自我增殖的能力及分化成为各种组织细胞的潜能,将干细胞诱导分化成为胰岛的内分泌细胞有可能成为解决胰腺供体缺乏的途径。
目的分离纯化大鼠胰腺组织干细胞,体外诱导其向胰岛内分泌细胞分化并形成胰岛样结构,评价干细胞分化胰岛的体外功能并观察其在实验性糖尿病模型中的治疗作用。
方法应用胶原酶消化法和密度梯度离心法从大鼠胰腺分离出胰岛和胰腺导管细胞;应用nestin结合的免疫磁珠从大鼠胰腺导管细胞中分离纯化得到少量胰腺组织干细胞.经体外扩增,将大鼠胰腺干细胞在加入ITS、尼克酰胺、bFGF等诱导剂的条件培养基及悬浮培养于含有细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分的条件培养基将大鼠胰腺干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞并形成胰岛样结构;对干细胞诱导分化形成的胰岛进行体外和体内的功能评价。
结果从大鼠胰腺分离获得胰岛及胰腺导管细胞于体外培养:采用nestin抗体包被的免疫磁珠将其中的胰腺组织干细胞纯化出来;在体外扩增后,将大鼠胰腺干细胞在加入ITS、尼克酰胺、bFGF等诱导剂的条件培养基及悬浮培养于含有细胞外基质成分的条件培养基将大鼠胰腺干细胞诱导分化形成胰岛样结构;经RT-PCR检测显示干细胞诱导分化的胰岛表达胰岛素的mRNA;免疫荧光染色显示,胰岛结构内含有大量胰岛素阳性细胞和少量胰高糖素阳性细胞;在葡萄糖刺激下干细胞分化胰岛有胰岛素释放,其释放量约为正常胰岛的39.4%;将干细胞分化胰岛移植到免疫缺陷的糖尿病小鼠后可以明显改善糖代谢的紊乱。
结论可以应用大鼠胰腺组织中nestin阳性的干细胞可以在体外制备成为具有治疗糖尿病功能的胰岛细胞。
【关键词】：胰岛移植 糖尿病 胰岛素 分离纯化 安全性 胰腺干细胞 胰岛素 糖尿病 诱导分化 胰岛移植 【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R587.1;R657.5
【目录】：
- 目录3-5
- 缩略语表5-7
- 第一部分 胰岛移植治疗糖尿病的临床前研究7-54
- 中文摘要7-9
- 英文摘要9-11
- 前言11-13
- 材料与方法13-26
- 1.主要实验试剂13-14
- 2.主要实验仪器设备14-15
- 3.实验动物15
- 4.主要实验方法15-25
- 5.统计学分析方法25-26
- 结果26-42
- 一、胰腺的获得及胰岛的分离纯化26-32
- 1.胰腺器官的摘取、保存和运输26
- 2.胰腺导管灌注消化酶26-27
- 3.建立胰岛分离和纯化系统27-28
- 4.胰腺供体消化前、后的一般情况28-29
- 5.胰岛纯化前、后的纯度29-31
- 6.分离纯化后胰岛的计数资料31-32
- 二、胰岛的功能评价和培养及冻存/复苏32-40
- 1.分离胰岛的活力检测32-33
- 2.分离胰岛的主要激素及胰岛自身抗体的mRNA表达33-34
- 3.分离胰岛的胰岛素释放功能检测34-35
- 4.透射电子显微镜观察分离胰岛细胞的胰岛素分泌颗粒35-36
- 5.分离胰岛的主要细胞组成及分布36-37
- 6.糖尿病模型的建立及胰岛移植治疗糖尿病裸鼠37-39
- 7.冻存/复苏前、后胰岛存活情况39
- 8.分离胰岛经冷冻/复苏后体外葡萄糖依赖的胰岛素释放功能39-40
- 三、胰岛的安全性评价40-42
- 1.细菌检测40
- 2.细菌内毒素检测40-41
- 3.促凝血活性的检测41-42
- 讨论42-48
- 结论48-49
- 参考文献49-54
- 第二部分 胰腺干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的实验研究54-76
- 中文摘要54-55
- 英文摘要55-57
- 前言57-58
- 材料与方法58-65
- 1.主要实验试剂58-59
- 2.主要实验仪器设备59
- 3.实验动物59
- 4.主要实验方法59-64
- 5.统计学处理64-65
- 结果65-69
- 1.大鼠胰腺干细胞的分离、纯化和扩增65
- 2.胰腺干细胞的体外定向诱导分化65-66
- 3.干细胞分化胰岛的功能评价66-69
- 讨论69-72
- 结论72-73
- 参考文献73-76
- 文献综述76-97
- 个人简历97-98
- 致谢98
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