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《中国协和医科大学》 2006年
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(-)棉酚的抗肿瘤作用及其与Imatinib协同诱导人慢性髓性白血病细胞凋亡

孟旸  
【摘要】: 棉酚是从棉籽中提取的一种多酚类化合物。研究表明,它对多种肿瘤都有杀伤作用。其中(-)棉酚成份被证明抗肿瘤效果最强。目前认为(-)棉酚的主要作用机制是抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-X_L。 慢性髓性白血病(CML)是一种血液系统恶性增生疾病。以细胞内出现嵌合蛋白Bcr-Ab1为主要特征。Bcr-Ab1是一种被持续激活的酪氨酸激酶,并激活多条信号传导通路,引起发病。 Imatinib(又称Gleevec,STI-571)是Bcr-Ab1的选择性抑制剂。在体内、体外实验中,Imatinib引起细胞凋亡,并且对临床上Bcr-Ab1阳性的患者有非常好的疗效。但是Imatinib对CML急变期的患者治疗效果却并不理想,而且很容易产生耐药。这促使人们不断寻找新的方案治疗CML。 本实验探讨了(-)棉酚与Imatinib联合应用对人CML细胞系K562的影响,以及(-)棉酚对K562细胞和K562耐Imatinib细胞系K562/R的抑制作用。 一、(-)棉酚及其与Imatinib合用对K562细胞的抑制作用 采用MTT的方法观察了(-)棉酚以及(-)棉酚与Imatinib联合应用对K562细胞的生长抑制作用。(-)棉酚抑制K562细胞生长,IC_(50)为5.22μmol/L。在6.25μmol/L浓度下,(-)棉酚使Imatinib对K562细胞的IC_(50)由1.56μmol/L降低到0.013μmol/L。说明(-)棉酚增强Imatinib对K562细胞的抑制作用。裸鼠中空纤维模型实验进一步证实,(-)棉酚可以抑制K562细胞在裸鼠体内的生长,并且(-)棉酚15mg/kg与Imatinib 30gmol/kg合用对裸鼠体内K562细胞抑制率达到93.7%。在10:1的比例下,用MTT方法得出(-)棉酚与Imatinib的联合指数<1,说明二者具有协同作用。 在体外(-)棉酚5μmol/L与Imatinib 0.5μmol/L联合作用使大量K562细胞出现核碎裂这种典型的凋亡形态学改变,而(-)棉酚5μmol/L,Imatinib 0.5μmol/L分别作用引起的改变则不明显。采用流式细胞术技术,Annexin V/PI双染及PI单染两种方法都得出(-)棉酚与Imatinib联合应用使凋亡细胞比例明显增加。另外,(-)棉酚单独作用也可以使K562细胞凋亡增加,并使细胞周期阻滞于G0/G1期,并且呈剂量依赖性。用DiOC_6染色方法观察了线粒体膜电位(△Ψm)的变化,这也是线粒体功能的一种反映。(-)棉酚和Imatinib分别单独作用时均可引起△Ψm降低,(-)棉酚与Imatinib联合作用则使△Ψm降低更为明显。 为了阐明(-)棉酚与Imatinib引起K562细胞凋亡的作用机制,本研究中采用western blot方法检测了caspase3和细胞质内细胞色素C含量的变化。(-)棉酚使K562细胞caspase3前体减少,释放入细胞质的细胞色素C含量增加;(-)棉酚与Imatinib联合应用时细胞色素C释放增多,caspase3前体进一步减少,并出现被水解的小片段,这意味着caspase3被激活。由此可以推断(-)棉酚和Imatinib作用后的K562细胞,细胞色素C释放入细胞质并随后激活caspase3,引起细胞凋亡。 为了进一步研究(-)棉酚与Imatinib引起K562细胞生长抑制并诱导凋亡的机制,采用western blot和RT-PCR方法分析了Bcl-2家族成员蛋白和mRNA水平的变化,以及P21的变化。(-)棉酚使Bcl-X_L、Mcl-1蛋白水平降低,并使Bcl-X_LmRNA表达也降低。与Imatinib合用时Bcl-X_L、Mcl-1进一步降低,并且使Bcl-2,Bcl-X_L,Mcl-1,Bak mRNA表达降低,Bad mRNA表达增加。(-)棉酚可以诱导K562细胞P21表达,但Imatinib却具有相反的作用。在实验中还发现(-)棉酚和Imatinib单独应用并未能使Bcr-Ab1和JNK蛋白含量改变,但二者合用却明显降低Bcr-Ab1和JNK蛋白水平。 由此可见,(-)棉酚通过诱导K562细胞凋亡和周期阻滞于G0/G1期,从而抑制K562细胞的生长。(-)棉酚增强Imatinib引起的K562细胞凋亡,并且二者具有协同作用。(-)棉酚所引起的凋亡至少部分通过线粒体途径,其中抗凋亡蛋白Bcl-X_L、Mcl-1的减少是其机制之一。尽管(-)棉酚对Bcl-2表达水平影响甚微,但是,目前普遍认为(-)棉酚通过结合于Bcl-X_L和Bcl-2而影响其功能,并不能改变其蛋白水平,因此可以推断在Bcl-X_L高表达的K562细胞内,(-)棉酚也降低了Bcl-X_L和Bcl-2的抗凋亡作用。(-)棉酚与Imatinib联合应用时引起了较为广泛的Bcr-Ab1传导通路和凋亡传导通路上的改变,其中包括Bcl-X_L、Mcl-1、Bcl-2、Bcr-Ab1、JNK不同程度的下调。(-)棉酚与Imatinib联合应用对细胞周期影响并不显著,而(-)棉酚引起的G0/G1期阻滞应与P21的诱导表达有关。 二、K562/R细胞株的建立以及(-)棉酚对K562/R细胞的抑制作用 通过逐渐增加Imatinib浓度施加于K562细胞的方法建立了K562耐Imatinib细胞系K562/R。与K562细胞相比,K562/R细胞对Imatinib敏感性降低约15倍,而两个细胞系对(-)棉酚敏感程度基本一致。K562/R细胞Bcr-Ab1以及线粒体Bcl-2表达增高,Mcl-1则无变化。令人费解的是,K562/R细胞Bcl-X_L表达却显著降低,因此初步认为,所建立的细胞系为Bcr-Ab1、Bcl-2高表达细胞系。进一步的鉴定工作有待深入。 MTT方法和裸鼠中空纤维模型实验都证实,(-)棉酚可以抑制K562/R细胞的生长。体外实验IC_(50)为7.97μmol/L,裸鼠体内实验(-)棉酚15mg/kg、30mg/kg剂量的抑制作用与对照组相比有显著性差异。在体外(-)棉酚10μmol/L使K562/R细胞出现典型的凋亡形态学改变。采用流式细胞术技术,(-)棉酚使K562/R细胞凋亡增加,并使细胞周期阻滞于G0/G1期,且呈剂量依赖性。(-)棉酚5μmol/L、10μmol/L引起K562/R细胞△Ψm降低。10μmol/L(-)棉酚引起K562/R细胞色素C释放。为了进一步研究(-)棉酚与Imatinib引起K562/R细胞生长抑制并诱导凋亡的机制,采用western blot和RT-PCR方法分析了一些Bcl-2家族成员蛋白和mRNA水平的变化。(-)棉酚使Bcl-X_L、Mcl-1蛋白水平降低,Bax、Bad、BakmRNA表达增加。与K562细胞不同,(-)棉酚并未诱导K562/R细胞P21表达(结果未给出)。 由此可见,(-)棉酚通过诱导K562/R细胞凋亡和周期阻滞于G0/G1期,抑制K562/R细胞生长;(-)棉酚通过上调促凋亡基因表达,下调抗凋亡蛋白水平从而引起K562/R细胞凋亡;(-)棉酚所引起G0/G1期阻滞可能与P21无关。 综上所述,(-)棉酚可能对CML治疗有效,尤其与Imatinib合用将会更有前景。当然,在应用临床之前,对于(-)棉酚的研究还有待于进一步深入。 棉酚作为一种避孕药,已经证实其还对多种肿瘤细胞系有生长抑制作用。我们通过实验验证了棉酚及其衍生物棉醌对肿瘤细胞的生长抑制作用。其作用强度从高到低依次为(-)棉酚、棉醌、(±)棉酚、(+)棉酚。(-)棉酚可以诱导人黑色素瘤细胞A375产生凋亡,但对A375细胞周期无明显影响。(-)棉酚增强A375细胞P53蛋白表达,可能与其诱导凋亡有关,但对Bcl-2 mRNA表达无影响。研究还发现(-)棉酚可降低B16BL6细胞的侵袭能力和恶性程度。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R730.5;R733.7

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