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《中国协和医科大学》 2006年
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SATB1通过改变核定位调控β-类珠蛋白基因表达

王赵  
【摘要】: 细胞核是复杂的有机体,包含各种各样动态分布的内容物。但是最新的实验结果显示细胞核其实是有序排布的,即使在有丝分裂的间期当染色质成疏松伸展状态存在时,也并不是想象中那样散乱分布。SKY技术利用不同荧光对不同染色体进行标记并将荧光转为光谱进而用精密仪器进行分析。分析结果显示不同染色体在细胞核内占有特定的空间区域,称为染色体区域。进一步实验分析还指出长时间沉默的基因以及大量的基因荒漠区通常位于染色体区域的内部,而活性表达的基因往往分布在染色体区域的表面,甚至环出,这与染色体间区分布有大量基因表达所需的调控复合物有关,这就是著名的CT-IC模型的基础理论。因此基因在细胞核内的定位就由原来简单分为异染色质区和常染色质区发展得更为深入了,基因在细胞核内的定位以及位置的变化与基因表达调控之间的关系也越来越受到重视。除了基因与自己所处的染色体区域之间的定位关系与基因表达水平有着密切的调控关系,实验还发现,基因与核周边或核中心区域的距离也具有基因表达调控功能。另外核基质作为细胞核内重要的结构,募集了大量与调控相关的转录因子和酶,实验结果发现与核基质的结合状况也与基因活化状况相关。因此基因在细胞核内不是随意排布的,定位往往与基因表达状态息息相关。 众所周知数以万计的基因并不是任何时间或在任何组织中都表达,组织特异性与发育阶段特异性是基因表达的重要特性,也是维持正常个体发育和细胞分化并行使正确功能的保障,无论是基因的表达时间还是组织发生紊乱都会导致细胞功能失常诱发疾病。既然基因的核定位对基因表达存在调控作用,那是否基因的核定位也相应地存在组织特异性和发育阶段特异性昵?实验结果证实了这种假想。基因在核内的定位是随着基因的活化与抑制而动态变化的。处于染色质内部或表面的基因在活化之后会向表面移动或是环出,而原本环出的基因则会在表达水平下降之后环进染色体区域。活性表达的基因往往会远离异染色质区域向常染色质区域靠近,而表达受抑制的基因则会向异染色质区域靠近更是早已发现的现象。基因与核基质的结合其实也是动态变化的,染色质DNA通过许多核基质结合序列与核基质结合,但是并不是所有的这些核基质结合序列都会与核基质结合,而是根据相邻的基因表达状态有选择的结合,而且当基因的表达状况在受到诱导前后发生变化后,与核基质结合的核基质结合序列也会发生变化,这一点也更加证实了核基质并不单纯是固定染色质的核内结构,它与基因的表达调控是密切相关的。 目前对于珠蛋白基因簇在核内的定位调控也有了一些认识,但是并不深入,多是集中在LCR对于β-珠蛋白基因簇核内定位的调控。我们的实验旨在探索珠蛋白基因簇在核内的定位以及该定位与核基质的关系。SATB1蛋白是近几年发现的T细胞特异性表达的核基质结合蛋白,在其它细胞中少有表达。SATB1蛋白可以相互聚合形成鸟笼样结构,并且此笼形结构的形成与和核基质正确结合是密切相关的,这不仅为基因表达调控提供平台,而且介导了基因与核基质的结合,接受核基质上募集的调控因子的调控。有实验发现在人红白血病细胞系K562中过表达SATB1蛋白,可以促进β-珠蛋白基因簇的活化,尤其促进胚胎型的基因表达。主要机理是在β-珠蛋白基因簇LCR区的HS2上以及ε基因的增强子区域有SATB1蛋白的结合位点,因此SATB1蛋白募集的一些去乙酰化抑制酶等染色质修饰蛋白就可以作用于这两点的染色质使其开放,促进基因表达。由于如前所述,SATB1形成的笼形结构可以募集染色质修饰蛋白,而且此作用与核基质密切相关,因此我们假设SATB1蛋白对于珠蛋白基因的调控可能与促使β-珠蛋白基因簇改变核定位有关,而这种核定位的变化有可能与同核基质结合密不可分。 为了证明我们的设想,我们构建了SATB1表达载体以及删除了核基质结合区的突变SATB1的表达载体,并分别转染K562细胞,获得稳定克隆后进行珠蛋白基因簇的定位分析。首先β-类珠蛋白基因的表达水平检测发现,SATB1过表达后可以增加ε基因表达而降低γ基因的表达,这与以前的实验结果吻合。而且与我们预期一致的是,在SATB1突变表达后这种调控结果减弱了。因此提示SATB1对于珠蛋白基因的表达调控可能与核基质的作用相关。然后,我们利用FISH技术观察了SATB1过表达及突变表达的情况下β-珠蛋白基因簇的核内定位情况。先以11号染色体区域为内对照观察,结果发现SATB1过表达后30%的β-珠蛋白基因簇发生了环出,与hemin诱导的K562细胞进行的阳性对照中的37%环出的结果相接近。但是出乎意料的是,在SATB1突变表达后,同样有33%的β-珠蛋白基因簇发生了环出。根据两种情况下珠蛋白基因表达水平的不同以及我们所做的突变分析,这两种情况下的核定位应该是有区别的。于是我们又以核基质进行内对照,对β-珠蛋白基因簇的核定位进行观察。结果发现,在SATB1过表达时,大部分β-珠蛋白基因簇是与核基质结合的,而当SATB1突变表达之后,虽然β-珠蛋白基因簇发生了环出,但是并不与核基质结合,而是处于核晕的部位。这与以往的实验发现用红系不表达的IgG基因簇上的LCR替代β-珠蛋白基因簇原位的LCR之后虽然促使了珠蛋白基因簇的环出,但是并不能转位使其远离异染色质区也不能促进珠蛋白基因的表达有相似之处。因此提示,β-珠蛋白基因簇的环出是调控珠蛋白基因表达的必要非充分条件,环出之后的具体定位也起重要作用。 另外由于核基质有多种转录调节因子结合,那么与核基质的不同结合状态是否会改变β-珠蛋白基因簇与重要反式因子的结合状况?我们利用ChIP技术观察β-珠蛋白基因簇与PolⅡ与GATA1的结合状态。结果发现,SATB1过表达后增加了HS2区域和ε基因的启动子区与PolⅡ的结合几率,同时降低了γ基因的启动子区与PolⅡ的结合几率。而在SATB1突变表达的情况下,三个观察点上的PolⅡ结合几率与正常K562细胞对照没有明显差别。关于GATA1,实验发现SATB1过表达后增加了HS2区域和GATA1的结合几率,但是降低了ε基因和γ基因GATA1结合位点的结合几率;而在SATB1突变表达的情况下,HS2区域和GATA1的结合几率降低了,ε基因与GATA1的结合几率没有明显规律,而γ基因的结合情况与正常对照没有差别.此结果与半定量PCR发现的正常SATB1蛋白促进胚胎期珠蛋白基因表达而降低胎儿期珠蛋白基因表达,突变SATB1蛋白不具有此调控效果的结果相一致,也提示SATB1蛋白可能通过介导β-珠蛋白基因簇与核基质的结合,改变与调控因子的结合状态从而调控珠蛋白基因表达。 基于我们的研究,我们提出关于SATB1调控β-珠蛋白基因簇机制模型的假想:SATB1蛋白相互聚合形成笼形结构,在聚合过程中促使与之结合的β-珠蛋白基因簇环出11号染色体区域,并且介导β-珠蛋白基因簇与核基质的结合。并且由于SATB1蛋白的结合位点主要是在HS2区域和ε基因的近端调控元件,因此在与SATB1蛋白结合的过程中促进了LCR与ε基因的结合,增强了ε基因的表达,而ε基因与γ基因之间对于LCR的竞争导致了LCR对γ基因的增强减少,导致γ基因表达降低。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q78

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