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《中国协和医科大学》 2008年
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靶向不同肿瘤基因的shRNA瞬时表达载体的构建及联合抗肿瘤活性的研究

孙环星  
【摘要】: 癌症的发生与多基因异常有关,包括癌基因的活化和抑癌基因的失活。RNA干扰被认为是一种非常有潜力的肿瘤治疗手段,利用RNA干扰技术抑制癌基因的表达可以逆转肿瘤的恶性表型。但仅就一个基因为靶点往往只能部分逆转肿瘤的恶性表型,治疗效果有限。为寻求更加理想的抗肿瘤效果,可以在两方面进行研究:第一是将RNA干扰技术联合化疗药物,第二是利用RNA干扰技术靶向多个癌基因。我们就这两方面进行了研究。 第一部分靶向N-Ras的shRNA联合长春新碱的抗肿瘤活性研究 肝癌是常见的恶性肿瘤之一,虽然有手术、放化疗和肝移植等治疗手段,但是肝癌的死亡率仍然很高,5年存活率小于11%,因此有必要寻找新的、更有效的治疗方法。已有研究显示,RNA干扰下调肝癌形成相关基因的表达能有效抑制肝癌细胞的生长。为了取得更好的效果,我们将靶向N-Ras的RNA干扰表达载体(pCSH1-shNR)与化疗药物长春新碱(VCR)联合进行肝癌的治疗研究。 一、pCSH1-shNR联合VCR的体外抗肝癌活性 SRB法检测pCSH1-shNR联合VCR对HepG2细胞的生长抑制。结果显示,pCSH1-shNR处理的细胞存活率为55.0%,1.5nM VCR的细胞存活率为77.24%,pCSH1-shNR与1.5nM VCR联合处理的细胞存活率为34.60%,两药相互作用系数(CDI)为0.76;VCR浓度为2.5nM时的细胞生存率为46.18%,pCSH1-shNR与2.5nM VCR联合处理的细胞存活率为17.32%,CDI为0.64。结果说明转染pCSH1-shNR联合长春新碱对HepG2细胞的生长有显著协同抑制作用。 pCSH1-shNR联合VCR对HepG2细胞克隆形成能力的抑制。单独转染pCSH1-shNR时,克隆形成率为50%,单独VCR(2.5nM)处理时,克隆形成率为13.75%,pCSH1-shNR与VCR联合时,克隆形成率为6.67%,与单独处理比较克隆形成抑制率有明显提高。 二、不同处理对增殖相关蛋白水平变化的影响 不同处理对蛋白激酶ERK1/2及Akt活性的影响。转染pCSH1-shNR使HepG2细胞中的ERK1/2和Akt的磷酸化水平下降;VCR处理后,ERK1/2和Akt的磷酸化水平也下降;pCSH1-shNR联合VCR组的ERK1/2和Akt的磷酸化水平下降幅度更大,说明pCSH1-shNR与VCR联合可以共同增强对Ras/Raf/MEK/ERK1/2和Ras/P13K/Akt通路的阻遏作用。 细胞核因子NF-κB是一种重要的核转录因子,其过表达和活化与癌症的发生相关。ERK1/2及Akt都参与对NF-κB的调节。在人多发性骨髓瘤细胞中,NF-κB的下调可以诱导细胞对VCR的化疗敏感性。我们检测了不同处理对NF-κB通路的影响,结果显示pCSH1-shNR与VCR联合处理组的NF-κB信号通路的活性被整体下调,并且被抑制的程度大于其它处理组。 表皮生长因子受体(EGFR)参与Ras信号通路的活性调节及细胞对VCR作用的响应,在HepG2中表达组成型的磷酸化EGFR。Westem Blot检测pCSH1-shNR及VCR处理对EGFR表达及活性的影响,结果显示pCSH1-shNR与VCR联合处理协同下调了EGFR的表达,N-Ras的表达抑制减弱了细胞响应VCR处理时对EGFR的活化。 三、pCSH1-shNR联合VCR对HepG2细胞周期分布的影响 流式细胞仪检测pCSH1-shNR联合VCR对HepG2细胞周期分布的影响。结果显示,pCSH1-shNR处理对HepG2细胞周期分布的影响不是很明显。用VCR(1.5nM和2.5nM)处理细胞后,低剂量VCR可以引起S期阻滞,高剂量VCR可以引起G2/M期阻滞,结果说明VCR引起的细胞周期阻滞是剂量依赖性的。pCSH1-shNR与VCR联合处理,结果显示pCSH1-shNR可以降低VCR引起的S期或G2/M期阻滞。 Western blot检测细胞周期蛋白(Cyclin)和依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(Cdk)的变化。结果显示,pCSH1-shNR、VCR、pCSH1-shNR与VCR联合处理都下调了cyclin D1、Cdk2、Cdk4和Cdk6的表达,与单独处理比较联合处理的下调作用显著提高。此外,pCSH1-shNR可以逆转VCR引起的cyclin E和cyclinB1的上调作用,VCR抑制pCSH1-shNR对Cdc2的上调作用。因此pCSH1-shNR与VCR联合处理使Cyclins和Cdks的整体活性水平趋于下降。 Western blot检测Rb磷酸化和E2F-1的表达水平。结果显示pCSH1-shNR使Rb磷酸化水平略有下调,E2F-1表达略有下降;VCR使Rb磷酸化水平大幅提高,E2F-1表达略有下降;pCSH1-shNR联合VCR使Rb磷酸化水平显著高于对照组,但也显著低于VCR组,联合组的E2F-1表达下降最多。结果说明pCSH1-shNR抑制了VCR刺激Rb磷酸化的作用,促进了对E2F-1表达的下调作用。 四、pCSH1-shNR联合VCR对HepG2细胞凋亡的诱导作用 流式细胞仪检测pCSH1-shNR联合VCR对HepG2细胞的凋亡诱导作用。结果显示,pCSH1-shNR的凋亡诱导率为6.07%,VCR的凋亡诱导率为12.29%,而pCSH1-shNR联合VCR的凋亡诱导率为22.82%,说明pCSH1-shNR联合VCR协同诱导HepG2细胞凋亡。 Western blot检测结果显示,pCSH1-shNR联合VCR协同诱导HepG2细胞凋亡与Bax无关,但pCSH1-shNR显著下调凋亡抑制蛋白Survivin的表达量,从而抑制VCR对Survivin的上调,降低了Survivin对凋亡的抑制作用,进一步增强了VCR对HepG2细胞的凋亡诱导作用。 五、pCSH1-shNR联合VCR诱导细胞衰老的作用 采用SA-β-gal染色法检测转染pCSH1-shNR联合VCR诱导HepG2细胞衰老的作用。结果显示,pCSH1-shNR的细胞衰老诱导率为11.32%,VCR(2.5nm)的细胞衰老诱导率为8.23%;pCSH1-shNR联合VCR的细胞衰老诱导率为18.76%。结果说明pCSH1-shNR联合VCR诱导细胞衰老的能力更强。 六、pCSH1-shNR对VCR诱导MDR1基因表达的影响 肿瘤细胞对VCR的抗性与MDR1基因表达产物P-糖蛋白(P-gp)的过表达有关,而ras癌基因可以调控MDR1基因的表达。Western Blot检测结果显示,在转染pCSH1-shNR后进行VCR处理的HepG2细胞内P-gp的升高幅度明显小于VCR处理组。 综上所述,pCSH1-shNR与VCR联合处理对HepG2细胞的生长产生了显著的抑制效果,细胞凋亡率增多,细胞表面的EGFR的表达和活性都降低,细胞内的ERK1/2和Akt的活性被协同抑制,Cyclin和Cdk的整体活性水平趋于下降,转录因子E2F-1和NF-κB的表达和活性被下调,pCSH1-shNR抑制了VCR引起的Survivin和MDR1基因表达上调。本研究结果提示,靶向特异基因的RNA干扰技术与化疗药物联合应用于肝癌治疗具有好的疗效。 第二部分MDM2和Pin1的shRNA表达载体构建及其抗肿瘤活性 MDM2的过表达可以抑制p53的功能,促进肿瘤形成。Pin1被认为是肿瘤发生的催化分子,在原癌基因信号转换中是一个不可缺少的翻译者和扩大者。本课题以多基因shRNA表达载体为基础,构建了MDM2和Pin1双干扰的shRNA表达载体,并研究其抗肿瘤活性。 一、靶向MDM2和Pin1的shRNA表达载体的构建 采用本室已证明可以有效抑制MDM2表达的RNA干扰序列,以及文献报道中已证明可以有效抑制Pin1表达的RNA干扰序列,将这两段序列构建到已有的多基因shRNA表达载体pCSH1-1中,新构建的载体命名为pCSH1-shPM。 二、pCSH1-shPM对靶蛋白表达的影响 实验选择人的成纤维肉瘤HT1080细胞进行研究。Western blot检测显示,转染pCSH1-shMDM2可以下调MDM2的表达,转染pCSH1-shPin1可以降低Pin1的表达,也可以使得MDM2的表达有所下降。转染pCSH1-shPM可以同时有效降低MDM2和Pin1的表达,对MDM2的下调程度略大于转染pCSH1-shMDM2组,说明抑制Pin1的表达可能下调MDM2的表达。进一步实验证明,在低表达Pin1的HT1080-shPin1稳定细胞系中,MDM2的表达量明显低于对照组,说明在HT1080细胞中抑制Pin1的表达确实可以下调MDM2的表达。 三、pCSH1-shPM对细胞生长的影响 SRB法检测不同处理对细胞生长的影响。结果显示,转染pCSH1-shPin1和pCSH1-shMDM2都对HT1080细胞的生长有抑制作用,转染pCSH1-shPM对细胞生长的抑制作用强于pCSH1-shPin1或pCSH1-shMDM2单独处理,说明同时抑制MDM2和Pin1的表达更有效地抑制了HT1080细胞的生长。 四、pCSH1-shPM对细胞运动能力的影响 采用划痕实验检测不同处理对细胞运动能力的影响。结果表明,转染pCSH1-shPin1、pCSH1-shMDM2和pCSH1-shPM都能够减弱HT1080细胞的运动能力,各个处理组间无差异,说明共同抑制Pin1和MDM2表达没有加强对细胞运动能力的抑制。 初步研究显示,双干扰载体pCSH1-shPM对HT1080细胞的抑制作用更强,其作用机制有待进一步深入研究。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R73-3

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