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压力性尿失禁患者基因表达谱及相关基因多态性研究

仝佳丽  
【摘要】: 研究背景 国际尿控协会(international continence society,SCI)明确规定,在腹压增加时出现不自主的尿道内尿失禁称为压力性尿失禁(SUI)。女性压力性尿失禁的发病率在40%左右,国际尿控协会将这一常见的中、老年人病视为一种国际性疾病加以研究。并认为其构成了社会和卫生问题,与盆腔器官脱垂(POP)共同被称为盆底功能障碍性疾病(PFD)。压力性尿失禁的病因和发病机制很复杂,有多因素参与,不单纯是解剖学理论,已经演变到功能性和解剖学并重的理论。生物体只有当它们受到一定因素影响,行使特定功能时,相关的基因才会表达。因此基因表达能揭示很多生物学过程。对环境、遗传或者生化信号发生反应时,基因表达会被激活或抑制数倍甚至数千倍,形成了特征性的基因表达图谱,称为某一生理/病理现象的“分子图像”,可以用于了解基因的功能和调控途径之间的相互关系,有助于对生物体发生的生理生化过程的认识。随着90年代中期微阵列芯片技术的应用,特别是人类基因组计划的完成,可以利用基因表达谱芯片得到组织标本的“分子图像”,然后对不同病理生理条件下得到的“图像”进行平行表达比较,从而在更深的水平认识器官的生理或病理现象。 研究目的 应用基因表达谱芯片研究SUI中的基因表达情况,筛选在SUI和正常对照之间差异表达的基因,并对相关的差异基因进行验证;通过比较绝经前后压力性尿失禁妇女差异表达基因mRNA和蛋白质水平表达,进而分析女性激素对SUI发病相关基因表达的调节机制,探讨SUI发生发展的分子机制。通过差异基因多态性与SUI易感相关性的研究,循征SUI发病的遗传学因素。 研究方法 1.在绝经状态、年龄、体重指数、产次、盆腔手术史等影响SUI发生的重要因素匹配的前提下,选取3例绝经后SUI与3例绝经后无SUI对照的尿道旁阴道组织标本。提取总RNA,并对总RNA进行定量、质检。采用RNA扩增标记法合成生物素标记的cRNA,与Human Genome U133 Plus 2.0芯片杂交。 2.用SAM软件筛选|score(d)|≥2,Fc值大于2或小于0.5的差异表达基因。用MAS2.0软件对差异表达基因进行基因功能分类注释(GO)和代谢通路分析(Pathway)。 3.实时荧光定量PCR、免疫组化技术、Western Blot技术检测绝经后SUI组和绝经后正常对照组差异表达基因mRNA水平和蛋白水平的表达,从而验证芯片的准确性,以进一步分析差异表达基因的功能。 4.实时荧光定量PCR、免疫组化技术、Western Blot技术检测绝经后SUI组和绝经前SUI组差异表达基因mRNA水平和蛋白水平的表达,分析女性激素对SUI发病相关基因表达的影响。 5.聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)分析差异基因多态性与SUI易感的相关性。 研究结果 1.提取总RNA经定量和电泳检测,质量满足芯片杂交要求。杂交后芯片的各项检测参数均达到质控要求,尿道旁阴道壁组织与基因表达谱芯片的杂交模型建立成功。 2.筛选出75个在SUI组和对照组之间差异表达的基因。其中包括3个功能未知的基因。31个基因在SUI组中表达上调,44个基因在SUI组中表达下调。差异基因涉及多种功能蛋白和代谢通路。其中SNARE神经递质传递通路、神经变性通路的相关基因变化最显著,包括GOSRl、ApoE、GRB2、GBA基因。 3.绝经后SUI组GOSRl、ApoE、GRB2、GBA在mRNA水平和蛋白水平的表达差异与芯片结果一致。 4.绝经后SUI组较绝经前SUI组的ApoE、GRB2蛋白表达上调,而GOSRl、GBA蛋白表达下调,差异无统计学意义。 5.SUI组和对照组ApoE等位基因频率经H.w.平衡定律检验,具有群体代表性。ApoE的3种等位基因频率及6种基因型在SUI组和对照组分布无统计学差异,SUI人群危险性等位基因e4的频率高于对照组;保护性等位基因e3的频率低于对照组。 结论 1.人类全基因组表达谱芯片是一种有效的高通量筛选SUI差异表达基因的研究方法。本实验以|score(d)|≥92,Fc92或Fc≤0.5为标准筛选出75个在SUI组和对照组之间差异表达的基因。其中包括3个功能未知的基因。31个基因在SUI组中表达上调,44个基因在SUI组中表达下调。 2.SUI的病理生理过程复杂,涉及多种功能蛋白和代谢通路。其中神经变性通路的基因表达产物所导致的神经损伤和退行性变与SUI的发生发展密切相关。 3.实时定量荧光PCR、Western Blot验证目标差异基因GOSRl、APOE、GRB2、GBA在SUI组的表达变化趋势与芯片一致,佐证了芯片结果的可信性,同时明确了其功能蛋白在SUI发生发展中的意义。 4.绝经后SUI患者阴道壁组织神经变性的相关基因mRNA水平和蛋白水平较绝经前SUI组升高,表明女性激素与神经变性的协同作用,是SUI发病的共同机制。 5.ApoE基因多态性与SUI的发病无相关性,但是等位基因e4仍可能是SUI发病的潜在危险因素。


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