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《中国协和医科大学》 2009年
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一株新Calicheamicins产生株小单孢菌C3509的发酵、分离纯化及其抗肿瘤活性研究

张文军  
【摘要】: 随着抗肿瘤“弹头”药物的抗体导向治疗的研究进展,使得一些高效但毒副作用较大的药物充分发挥抗肿瘤作用的同时避免其毒副作用。高效“弹头”药物已成为治疗肿瘤的一种利器。我们实验的目的是对用精原细胞法筛选到的菌株C-3509发酵产物分离纯化,寻找高效抗肿瘤“弹头”药物,并对其抗肿瘤活性、机理进行研究。 分类培养采用通常有代表性的培养基及国际链霉菌规划会议拟定的培养基(简称ISP培养基),28℃静止培养21天,观察C-3509菌株的培养特征。颜色鉴定参考Ridgwa图谱;生理生化实验参照文献方法;细胞壁化学组份研究参照Backer、Lechevalier和Hasegawa的方法;磷酸类脂、醌类及G+C mo1%的分析按照中国科学院微生物所Ross、阮继生的方法进行。根据理化特征、生理特征及初步的16s DNA对菌株C-3509分类,其属于棘孢小单孢菌属(M echinospora)。与M.echinospora subsp.Calichensis cheamicins的产生株比较,C-3509在孢子形态、ISP系列培养基上的培养特征及对碳源利用的偏好与之不同。此外,在生长温度、细胞壁组成成份上两者也有所差别。 我们在本实验室前期研究的基础上设计了含不同组份的培养基,比较其活性产物的含量。对活性产物含量高的培养基,用响应曲面法(response surfacemethodology RSM)对其培养基组份配比进行优化,首先用部分因子实验设计(Fractional Factorial Design FFD)筛选其中影响实验结果的重要因素(组份),然后重点考察筛选出的重要因素,用梯度寻优法使得因素取值接近最优化水平。我们用响应曲面法对发酵培养基优化后,分别用原发酵培养基和改进的发酵培养基进行发酵,重复两次,用DNA断裂法检测活性产物的含量,改进后的培养基发酵液对DNA切割能力比初始培养基发酵液的DNA切割能力强约30倍。 接着我们用大孔吸附树脂柱层析、乙酸乙酯萃取、正已烷沉淀、硅胶柱层析、薄层层析、高效液相制备柱层析等方法分离纯化活性产物。纯化的产物通过ESI-MS来确定其分子量,HR-ESI-MS来确定其分子式。我们根据上述的纯化方法得到粗品3,然后将粗品3用HPLC-MS分析,发现其中有四种组份组份A、组份B、组份C、组份D分子量分别为1321,1367,1344,1381,分别与已知的化合物calicheamicinγ1~(Br),calicheamicinγ1~(I)。,calicheamicinβ1~(Br),calicheamicinβ1~(I)分子量相同。我们对其中含量高的B组份进一步分离,得到纯度为87.8%的C-3509B,HR-ESI-MS确定其分子式C_(55)H_(74)N_3O_(21)S_4I,辅以~1H-NMR的分析,基本确定C-3509B是已知的烯二炔类抗肿瘤抗生素calicheamicinγ_1~I。 我们用DNA断裂法、MTT法检测了C-3509B的生物学活性及细胞毒性。用流式细胞术检测了不同浓度C-3509B对人肝细胞周期阻滞情况。用Western blot检测低浓度的C-3509B引起HepG2细胞周期阻滞的分子学机制。DNA断裂法检测C-3509B的最小DNA损伤浓度为0.02μg/ml,MTT法检测C-3509B对多种细胞有极强的杀伤性。流式细胞术检测表明低浓度C-3509B处理人肝癌细胞会引起细胞周期阻滞,高浓度的C-3509B处理人肝癌细胞会引起细胞内的DNA断裂。Westernblot检测表明,在C-3509B诱导Hep G2周期阻滞中可能与ATM/CHK2信号通路有关。 我们以精原细胞法筛选到的小单孢菌菌株C-3509为出发菌,通过对其发酵条件的优化提高活性物质在发酵液中的含量,分离纯化出C-3509B。经过ESI-MS,HR-ESI-MS,UV和DNA断裂活性分析,推断C-3509B为Calicheamicinγ_1~I。我们对菌株C-3509分类研究表明,其是一株不同于M.echinospora subsp.Calichensis的棘孢小单孢菌。不同浓度的抗生素C-3509B对细胞有不同的损伤作用,低浓度的C-3509B会引起细胞G2/M期阻滞。C-3509B诱导Hep G2周期阻滞中可能与ATM/CHK2信号通路有关。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R914;R730.5

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 何琪杨,姜兵,李电东,甄永苏;力达霉素对人肝癌bel-7402细胞凋亡基因表达和细胞骨架的影响[J];癌症;2002年04期
2 邵荣光,甄永苏;烯二炔类高效抗肿瘤抗生素研究进展[J];国外医药(抗生素分册);1995年03期
3 杨秀萍;稀有放线菌产生的高效抗肿瘤抗生素[J];微生物学通报;1995年01期
4 胡昌勤;刘敏;邵荣光;邵波;戴红;李群;;力达霉素效价单位及效价测定方法的确定[J];药物分析杂志;2004年05期
5 李丽,顾觉奋,吴梧桐;烯二炔类抗肿瘤抗生素单克隆抗体导向药物研究进展[J];药物生物技术;2005年04期
6 顾觉奋,袁瑞瑛;烯二炔类抗生素的研究新进展[J];药学进展;2005年10期
7 宋旭,包明敏,崔大鹏,王真,李电东;抗肿瘤抗生素C1027对人结肠癌HCT-8细胞凋亡相关基因表达的影响[J];药学学报;1999年10期
8 李电东;;细胞裂亡及其分子机制研究[J];医学研究通讯;2005年07期
9 邵荣光;甄永苏;;烯二炔类抗肿瘤药物的研究与开发[J];中国处方药;2006年12期
10 杜康平,王静,姜蓉,李宝义,吴剑波;小单孢菌C5308脂溶性活性成分B的分离和结构鉴别[J];中国抗生素杂志;2000年05期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 段淑蓉;;几种利用抑制剂分离稀有放线菌的方法[J];安徽农学通报(上半月刊);2009年23期
2 刘秀均,戴垚,商悦,李毅,甄永苏;力达霉素对小鼠结肠癌生长及其肝转移的抑制作用[J];癌症;2005年06期
3 李耀军,高萍,柳惠图,张伟;力达霉素对人红白血病K562细胞死亡的影响[J];北京师范大学学报(自然科学版);2005年04期
4 尧蒙,蔡家利,吴胜昔,夏春玲;抗体在生物医学中的研究进展[J];重庆工学院学报;2005年08期
5 ;Tetraarsenic Tetrasulfide Induced Colon Cancer ls174t Cells Apoptosis[J];Chemical Research in Chinese Universities;2009年02期
6 张迎春;艾木拉古丽·阿布拉;杨秀萍;;烯二炔类高效抗肿瘤抗生素Calicheamicin的研究进展[J];国外医药(抗生素分册);2008年01期
7 王元;高向东;顾觉奋;;烯二炔类抗生素生物合成研究进展[J];国外医药(抗生素分册);2008年02期
8 晁伟峰;杨润蕾;吕志堂;赵宁;张利平;;150株小单孢菌的分类及生物活性[J];河北大学学报(自然科学版);2006年01期
9 郑喜;金志华;梅乐和;张达;;普那霉素发酵与吸附分离耦合过程动力学[J];化工学报;2010年03期
10 李灵;黄风迎;黄用豪;周松林;郭峻莉;赵焕阁;谭光宏;王华;;小型化Endoglin抗体与阿霉素偶联物的抗肿瘤作用研究[J];四川大学学报(医学版);2012年03期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 张丽;肖佳华;田云龙;刘雪;朱昌雄;;放线菌资源的重要性及相关菌种的分类鉴定[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
2 毛根祥;张文军;赵春燕;胡继兰;邵荣光;甄永苏;李电东;;抗肿瘤抗生素C3509B的研究[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
3 毛根祥;张文军;赵春燕;胡继兰;邵荣光;甄永苏;李电东;;抗肿瘤抗生素C3509B的研究[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李其利;链霉菌JK-1的鉴定及其防病潜能和防病机制的研究[D];华中农业大学;2011年
2 王风强;以Ⅳ型胶原酶为靶点的单抗导向药物的抗肿瘤作用以及建立Ⅳ型胶原酶抑制剂筛选模型的研究[D];中国协和医科大学;2002年
3 何琪杨;力达霉素引起肿瘤细胞死亡的分子机制[D];中国协和医科大学;2001年
4 唐勇;抗Ⅳ型胶原酶单链抗体及其融合蛋白的研究[D];中国协和医科大学;2001年
5 廖志勇;抗肿瘤抗生素C-3509以及抗肿瘤生化调节剂Geldanamycin的研究[D];中国协和医科大学;2000年
6 陈红霞;表皮生长因子受体配体寡肽与力达霉素组成的基因工程强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性的研究[D];中国协和医科大学;2005年
7 戴垚;抗Ⅳ型胶原酶单抗及其Fab'片段的免疫显像以及与平阳霉素新型免疫偶联物的制备和抗肿瘤活性研究[D];中国协和医科大学;2005年
8 梁越欣;力达霉素诱导细胞裂亡的分子机制研究[D];中国协和医科大学;2005年
9 李亮;抗Ⅳ型胶原酶单抗scFv片段与力达霉素构建的基因工程强化融合蛋白及其抗肿瘤作用的研究[D];中国协和医科大学;2003年
10 龙建友;秦岭链霉菌开发利用的前期基础研究[D];西北农林科技大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孙立新;肺癌抗体靶向治疗与新型工程抗体药物的研究[D];北京协和医学院;2011年
2 龙建友;新型农用抗生素的筛选研究[D];西北农林科技大学;2003年
3 胡艳红;土壤放线菌中抗肿瘤有效成分的分离及结构鉴定[D];哈尔滨工程大学;2004年
4 侯香萍;甲肝病毒L-8株单克隆抗体的制备与鉴定[D];昆明医学院;2006年
5 倪亚萍;肺癌相关蛋白的纯化[D];昆明医学院;2006年
6 孙强;新型抗真菌抗生素SN06的分离纯化研究[D];中国科学院研究生院(大连化学物理研究所);2007年
7 张乾顺;黄绿木霉菌抑菌活性成份的纯化及其对人工细胞膜的影响[D];黑龙江八一农垦大学;2008年
8 王妍;6-氟-3-溴代乙酰胺苯甲酰脲(S45)和6-氟-3-碘代乙酰胺苯甲酰脲(S47)的抗肿瘤作用与分子机理[D];中国协和医科大学;2007年
9 张砚君;白血病干细胞靶向治疗及耐药逆转[D];中国协和医科大学;2008年
10 曹兰兰;新疆哈密地区盐湖放线菌多样性及多相分类研究[D];新疆农业大学;2009年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 廖志勇,张胜华,甄永苏;Geldanamycin增强顺铂的抗肿瘤作用[J];癌症;2000年08期
2 何琪杨,姜兵,李电东,甄永苏;力达霉素对人肝癌bel-7402细胞凋亡基因表达和细胞骨架的影响[J];癌症;2002年04期
3 刘秀均,戴垚,商悦,李毅,甄永苏;力达霉素对小鼠结肠癌生长及其肝转移的抑制作用[J];癌症;2005年06期
4 李耀军,高萍,柳惠图,张伟;力达霉素对人红白血病K562细胞死亡的影响[J];北京师范大学学报(自然科学版);2005年04期
5 甄永苏;肿瘤的靶向治疗[J];国外医学(肿瘤学分册);2002年05期
6 邵荣光,甄永苏;烯二炔类高效抗肿瘤抗生素研究进展[J];国外医药(抗生素分册);1995年03期
7 顾觉奋,韩利;calicheamicinone的化学合成及其衍生物的构效关系[J];国外医药(抗生素分册);1997年05期
8 李卓荣,朱锦桃,张致平;烯二炔类抗癌抗生素的前药研究[J];国外医药(抗生素分册);1998年01期
9 许永杰,李电东,甄永苏;具有强烈杀伤肿瘤细胞活性的新抗肿瘤抗生素C1027分子作用机制[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1992年08期
10 李敏,刘文,李元;新型抗肿瘤力达霉素合成酶基因sgcD的克隆、表达和性质研究[J];中国科学(C辑:生命科学);2003年01期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 徐玉宝,王新朝,林青梅,马玉英,许东,李洪,陈琛;接苯工人外周血微核率的检测和DNA断裂的彗星实验[J];毒理学杂志;2005年03期
2 唐蓓;吴凯;吴丹;常青;刘丹丹;袁均林;;邻苯二甲酸丁基苄酯致小鼠肥大细胞DNA损伤的初步研究[J];生态毒理学报;2008年04期
3 张馨;李万湖;刘玉梅;雍凌;李宁;张文众;;多层电泳槽在彗星试验中的应用[J];中国食品卫生杂志;2011年02期
4 王宇卉,邵福源,夏春林;大鼠局灶性脑缺血/再灌注后单、双链DNA断裂的实验研究[J];交通医学;2003年05期
5 高翠莲;陈玉川;肖俊辉;靳俊峰;罗光华;;TUNEL法检测大鼠死后心肌细胞核DNA断裂与死亡时间关系研究[J];中国法医学杂志;2007年05期
6 刘颖;齐浩;孙润广;陈文芳;郭伟;;原子力显微镜观测紫外线诱导的K562肿瘤细胞DNA损伤[J];生物技术通报;2009年07期
7 高云燕;刘丽华;欧植泽;李嫕;杨国强;王雪松;;胆固醇修饰富勒烯/γ-环糊精包结复合物的生物活性[J];物理化学学报;2010年02期
8 马靖,庞大本,池旭生,彭文烈,徐安龙;药物诱导细胞凋亡时DNA检测技术的探讨[J];癌症;2000年08期
9 马爱国,刘四朝,杜卫;核酸内切酶在DNA断裂损伤检测中的应用研究[J];中国公共卫生;2000年02期
10 张燕辉;陈效黎;;男性沙眼衣原体和支原体等泌尿生殖系统感染不育患者精子DNA断裂情况检查及意义[J];中国卫生检验杂志;2009年02期
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1 黄灿;许杜娟;夏泉;苏勇;;MAPK信号转导通路介导黄芪皂苷Ⅱ逆转人肝癌细胞Bel-7402/FU耐药的调控机制[A];中国药理学会第十一次全国学术会议专刊[C];2011年
2 梁玉龙;雷霆雯;吴衡;苏剑敏;王丽影;雷群英;查锡良;;β1族整合蛋白过表达对人肝癌细胞细胞周期的调控及其机制研究[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2003年学术交流会论文摘要集[C];2003年
3 王灿;王丽影;李增霞;查锡良;;人肝癌细胞SMMC-7721中过表达N-乙酰氨基转移酶V(GnT-V)影响受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa(RPTPκ)结构完整性和生物学功能[A];2008年全国糖生物学学术会议论文摘要[C];2008年
4 韩云峰;赵明;陈璟;朱小华;沈美娟;;Ad-hNIS体外转染人肝癌细胞及细胞内hNIS表达水平的检测[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年
5 程文;荆慧;张久维;;超声介导靶向微泡促进c-myc ASODN在肝癌细胞的表达[A];中华医学会第十次全国超声医学学术会议论文汇编[C];2009年
6 边春景;邵荣光;;RNA干扰MR-1基因诱导人肝癌细胞BEL-7402凋亡的研究[A];第四届中国肿瘤大会中国药理学会肿瘤药理专业委员会分会场学术会议论文摘要[C];2006年
7 张弘;柳惠图;;CKIp15~(INK4B)高表达对人肝癌细胞G1/S和G2/M进程的影响[A];中国细胞生物学学会第七次会议论文摘要汇编[C];1999年
8 崔立刚;张武;王金锐;周柔丽;;鱼肝油酸钠抗肝癌细胞作用及机制的实验探讨[A];2003年全国医学影像技术学术会议论文汇编[C];2003年
9 崔杰峰;刘银坤;宋海燕;张子;孙瑞霞;陈洁;冯钜涛;于雁灵;申华丽;杨芃原;;人肝癌细胞转移相关分子的比较表达蛋白质组学分析[A];中国蛋白质组学首届学术大会论文摘要集[C];2003年
10 徐大勇;汪蕴;丰美福;;模拟微重力状况下人肝癌细胞HepG2的生长特性与机理研究[A];中国空间科学学会第16届空间生命学术研讨会论文摘要集[C];2005年
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2 朱四倍;关注博士培养最终质量不如关注过程[N];科技日报;2011年
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4 记者奚平;德国防部长涉嫌抄袭 或丢学位危及前程[N];中国社会科学报;2011年
5 王鸣阳;科学创新需要怎样的外部条件?[N];中华读书报;2010年
6 本报通讯员 项健 邹一娇 本报记者 靳晓燕;博士是“读”出来的吗?[N];光明日报;2011年
7 沈兆乾;出版全部博士论文[N];人民日报海外版;2001年
8 清华大学法学博士 高杨;别让“评审结论”再尴尬[N];法制日报;2009年
9 记者 傅云、记者 魏星;我省举行博士服务团总结暨欢迎会[N];江西日报;2006年
10 胡培兆;评说经济学博士论文[N];光明日报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张文军;一株新Calicheamicins产生株小单孢菌C3509的发酵、分离纯化及其抗肿瘤活性研究[D];中国协和医科大学;2009年
2 张淑红;PDCD4抑制人肝癌细胞转移潜能的研究[D];山东大学;2009年
3 李苏宜;重组人生长激素干预GHR不同表达水平人肝癌细胞的实验研究[D];郑州大学;2010年
4 宋长城;蜂毒素抗肝细胞癌血管生成的实验研究[D];第二军医大学;2007年
5 胡轶红;两个肿瘤相关基因的结构与功能—细胞极性蛋白hASIP的不同转录本对人肝癌细胞周期和Fas/FasL介导的细胞凋亡的调节及新基因F-lana的转化作用[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2005年
6 郑科;CXCL12/CXCR7调节人肝癌细胞侵袭和血管生成能力的实验研究[D];重庆医科大学;2010年
7 张如刚;端粒酶活性与肝癌细胞生长的控制[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2002年
8 肖钟迪;肺癌肿瘤抑制物1(TSLC1)抗人肝癌细胞HepG2的实验研究[D];吉林大学;2010年
9 焦健华;Opsin3基因与人肝癌细胞5-氟尿嘧啶耐药性关系的研究[D];南京医科大学;2009年
10 高雪峰;UHT纯牛奶质量改进方法与应用研究[D];天津大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 厉永强;胡椒醛环丙沙星酰腙诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的作用[D];河南大学;2010年
2 臧世利;IFN-a联合5-FU对人肝癌细胞HepG-2 DLC-1、Bcl-2表达的影响[D];山西医科大学;2010年
3 刘庆元;人肝癌细胞GnRH及其受体的研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
4 王晓琳;PAMAM-eIF4E-shRNA纳米微粒对人肝癌细胞抑制作用实验研究[D];第二军医大学;2010年
5 罗小洋;siRNA沉默p62基因对人肝癌细胞Hep3B的生物学影响[D];南昌大学;2010年
6 翟东霞;蜂毒素诱导人肝癌细胞株Bel-7402恶性表型转化的实验研究[D];第二军医大学;2004年
7 任争;喹诺酮类衍生物诱导人肝癌细胞凋亡作用的研究[D];河南大学;2010年
8 周源;调控mPTP与人肝癌细胞多药耐药关系的实验研究[D];第三军医大学;2010年
9 董玉芳;Thiostrepton靶向作用FOXM1转录因子在抑制人肝癌细胞增殖中的作用初探[D];重庆医科大学;2010年
10 成涓;超声激活血卟啉对人肝癌细胞株HepG2抗失巢凋亡能力的影响及其机制初探[D];重庆医科大学;2008年
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