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《中国协和医科大学》 2009年
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HCV 1b亚基因组复制子细胞模型的建立及药物初步筛选

陈慧毅  
【摘要】: 丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)是丙型肝炎的致病体,丙型肝炎是世界范围内的重要传染病之一。据估计,目前世界上有1.7亿多人感染该病毒,占人口总数的3%。HCV大部分感染者发展成慢性肝炎,并最终导致肝硬化和肝癌。目前对HCV的预防和治疗十分有限,迄今还没有疫苗问世。对HCV感染者最有效的治疗方法为聚乙二醇干扰素联合利巴韦林,持续病毒学应答率对基因型有很强的依赖性,即不同的基因型对治疗反应差异很大。此外,其治疗费用颇高,且具有显著的副作用。因此,迫切需要更加有效的治疗方法。但是,这方面的研究进展不明显,主要原因是没有合适的细胞模型可以有效支持HCV病毒的复制。 直到1999年,复制子模型的出现使HCV细胞模型的研究向前迈了一大步。HCV亚基因组复制子模型使病毒复制子第一次在人源肝癌细胞系中大量复制,成为HCV病毒研究的有效工具。 本研究利用构建成功的中国人群中HCV 1b亚基因组复制子质粒,采用体外转录的方法获得HCV 1b亚基因组复制子RNA,并通过电穿孔的方法转染细胞系Huh-7.5.1,经过G418药物筛选6周后,获得了大量高效复制HCV 1b亚基因组复制子的细胞集落。在此工作基础上,为了筛选到具有稳定遗传和高效复制的细胞单克隆,我们在获得的细胞集落中,挑选90个单克隆进行单克隆化培养,最终得到三个具有稳定遗传和高效复制的细胞单克隆。本研究运用RT-PCR技术和WesternBlot技术验证细胞中HCV亚基因组复制子的存在,并且通过Real-time PCR检测细胞中HCV亚基因组复制子的拷贝数,进一步证实了该细胞模型中存在HCV 1b亚基因组复制子,并存在大量的拷贝。 与此同时,本研究采用干扰素-α和利巴韦林处理细胞模型,检测到细胞中HCV亚基因组复制子的拷贝数明显下降,成功模拟了药物筛选的过程,为未来的抗病毒药物的筛选和评价提供有力的工具和实验方法。 同时,本研究还通过原核表达体系和昆虫杆状病毒表达体系表达HCV非结构蛋白,目的是获得HCV亚基因组中各非结构蛋白,用于抗病毒机制的研究。 本研究成功建立了支持中国人群HCV 1b亚基因组复制子高效复制的体外细胞模型,为进一步研究HCV致病机制、治疗药物筛选及疫苗方面打下了基础。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R96

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