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《中国协和医科大学》 2009年
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Flt-1胞外Ⅲ区基因克隆、表达研究及其单克隆抗体的制备

谢印良  
【摘要】: 肿瘤发生侵袭和转移是临床治疗肿瘤失败的主要原因之一,因此,围绕阻断肿瘤转移的研究已成为肿瘤治疗的基础和临床研究的热点之一。近几十年来,大量研究结果已证实肿瘤的增殖、侵袭和转移依赖于肿瘤的血管新生(angiogenesis),这一发现极大的促进了该领域的研究开展。随着血管新生相关机制研究的深入,越来越多基础和临床研究证实了通过抑制肿瘤血管新生来抑制肿瘤生长的理念。 血管新生是一个复杂的多步骤调控的过程,包括内皮细胞的分化、增殖、迁移和重塑,与肿瘤的生长和转移高度相关。血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)是血管新生的重要调节因子,在实体瘤和血液系统肿瘤的血管新生中起重要作用。血管内皮生长因子受体Ⅰ(fms-like tyrosinekinase,Flt-1)是VEGF受体之一,不仅表达于血管内皮细胞,肾小球系膜细胞,胎盘滋养层,单核巨噬细胞,而且在许多实体瘤及血液肿瘤细胞中都有高表达。目前研究认为,Flt-1在不同的生理或病理条件下的血管生成过程中具有双重作用,在胚胎期能够负性调节血管生成,但在成人期病理情况下Flt-1与VEGF结合后,则能够增加血管内皮细胞通透性,使血管内的蛋白外渗,形成内皮细胞迁移的支架和临时基质,并引发单核细胞和巨噬细胞的趋化,还能通过与PIGF结合来刺激干细胞的募集和活性,从而促进血管新生。因此阻断与Flt-1有关的信号传导有着潜在的抑制肿瘤血管新生的作用。 Flt-1属酪氨酸蛋白激酶第Ⅲ亚型,其结构分为胞外区,跨膜区和胞内区三个部分,在其胞外区的7个免疫球蛋白样结构域中,氨基端的Ⅰ-Ⅲ区是Flt-1的配体结合域所在区。本文的主要目的是表达Flt-1胞外Ⅲ区蛋白并检测其生物活性,制备抗Flt-1胞外Ⅲ区的单克隆抗体,探讨其生物活性,为以后制备基因工程抗体作好准备工作。通过从人胎儿脐静脉内皮细胞提取总RNA,利用RT-PCR和PCR方法克隆Flt-1胞外Ⅲ区的基因,通过与表达载体pAYZ(含有碱性磷酸酶(phoA)启动子和引导肽stll)进行相同的酶切消化,构建成Flt-1胞外Ⅲ区的表达载体pAYZFIt-1,并在大肠杆菌16c9中诱导表达,表达产物以可溶性形式存在于细胞周质腔中,SDS-PAGE和Western blot分析显示,其分子量约为15kD,经E-tag亲和层析柱纯化,纯化产物经ELISA、单层细胞划痕损伤、Transwell体外实验检测表明具有结合VEGF以及抑制脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移的活性。 纯化目的蛋白免疫Balb/c小鼠,采用传统B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗Flt-1胞外Ⅲ区的单克隆抗体,采用ELISA和流式细胞术方法筛选阳性克隆,利用Western blot及流式细胞术印证了单克隆抗体与抗原及细胞膜蛋白的结合活性,运用竞争ELISA方法测定了单克隆抗体与抗原的亲和活性,为以后的基因工程抗体工作奠定了基础。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R730.2

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