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《中国协和医科大学》 2008年
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固化的金属离子亲和层析和质谱联用鉴定磷酸化多肽的策略优化和快速老化小鼠脾淋巴细胞衰老相关的蛋白质组研究

李耀军  
【摘要】:一、固化的金属离子亲和层析和质谱联用鉴定磷酸化多肽的策略优化 可逆磷酸化是一种重要的细胞信号传导模式,也是调节蛋白质表达和功能的核心机制,因而参与调节了绝大多数的细胞生命活动。由于磷酸化蛋白质的相对低丰度、负电性和相对的亲水性,所以磷酸化蛋白质或多肽的富集和提高质谱仪的灵敏度就显得十分重要。近年来,作为一种快速、简单易用和经济的策略,固化的金属离子亲和层析技术(IMAC)被研究者广泛地应用于磷酸化多肽的富集。应用该方法时,研究者们把主要注意力放在如何降低那些含有酸性侧链氨基酸(如谷氨酸和天门冬氨酸)的非磷酸化多肽对富集磷酸化多肽的影响上。然而,混在蛋白样品中的核酸对于IMAC富集磷酸化多肽的影响却未见报道。目前主要有两种IMAC策略被应用,一种需要甲酯化处理样品的IMAC(ME-IMAC)策略和另一种不需要甲酯化处理样品的IMAC(Non-ME-IMAC)策略。本项研究首先通过对两种IMAC策略的比较实验,证明ME-IMAC策略容易造成样品丢失和增加质谱分析的复杂度,而Non-ME-IMAC策略才是更为简单有效的磷酸化多肽富集策略。接着,我们对Non-ME-IMAC策略进行了较为细致的优化。发现理想的Non-ME-IMAC上样/洗涤溶液是8%ACN/0.3%TFA,最理想的洗脱液是0.2 mol/L磷酸氢铵(pH8.0)。另外,更为重要的是,我们发现在强酸性条件(pH<1.9)下,IMAC介质对核酸尤其是单链的或者包含单链区的核酸有很强的亲和力,具有平端双链的PCR-product则只具有部分亲和力。经过进一步研究,我们首次指出对于核酸尤其是单链的或者包含单链区的核酸对采用IMAC策略富集磷酸化多肽有显著的不良影响,对磷酸化多肽的信号抑制率超过70%。然后,我们找到了一种简单有效的去除核酸,并能降低核酸对IMAC富集磷酸化多肽不良影响的方法——乙腈沉淀法。使用乙腈沉淀去除核酸的样品与不去除核酸的样品相比,磷酸化多肽的富集率可以提高2倍以上。本项研究为磷酸化蛋白质组学的研究提供了有价值的参考。 二、快速老化小鼠脾淋巴细胞衰老相关的蛋白质组研究 在动物和人中,衰老可引起许多功能退行性疾病,包括老年性痴呆、帕金森氏病及免疫功能失调等。快速老化小鼠属于近交系小鼠,随着月龄增加会出现许多与衰老相关的功能紊乱,其许多病理学特征与人类衰老时的病理学特征十分相似,因此,快速老化小鼠是一个很好的衰老动物模型。为了研究SAM鼠脾淋巴细胞中和衰老相关的蛋白质组,以9个月龄的SAMP8和SAMR1的脾淋巴细胞为材料,用双向电泳分析脾淋巴细胞差别蛋白组。结果找到了21个差别点,13个点在SAMP8脾淋巴细胞中的表达量较SAMR1高2倍以上,8个点在SAMR1脾淋巴细胞中的表达较SAMP8高2倍以上。然后使用MALDI-TOF质谱仪,加上MASCOT数据库搜索,鉴定这些差异蛋白点。我们进一步使用Western-blot的方法,对于SAMP8脾淋巴细胞中高表达的蛋白质AnnexinⅠ进行了再验证。对于其他所鉴定蛋白和衰老相关的功能进行了讨论。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q51

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