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《中国协和医科大学》 2009年
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2,4-二甲氧基反式芪(S3)抗实验动物老年痴呆作用机制初步研究

阮灿军  
【摘要】:木豆叶芪类提取物(sECC)的合成类似物2,4-二甲氧基反式芪(S3)为芪类化合物。本实验室既往发现,sECC具有广泛的药理活性,如抗骨质疏松作用及降血脂等活性。本文主要就S3抗实验动物老年痴呆作用机制及其初步安全性进行了探讨。 一.S3对体外培养的SH-SY5Y细胞的保护作用 1.采用H_2O_2损伤SH-SY5Y细胞,观察S3对SH-SY5Y细胞的保护作用。SH-SY5Y细胞给药2h后,与H_2O_2(100μmol/L)共同孵育12h,采用MTT法和流式细胞仪法检测细胞活力与细胞凋亡。结果发现,与对照组比较,S3能以浓度依赖方式提高细胞活力,分别提高19%,15%和8.3%(P<0.01);同时发现,S3能降低细胞凋亡率。本实验提示,S3能改善H_2O_2诱导SH-SY5Y细胞活力的降低,减少H_2O_2诱导SH-SY5Y细胞凋亡。 2.采用Aβ_(25-35)损伤SH-SY5Y细胞,观察S3对SH-SY5Y细胞的保护作用。SH-SY5Y细胞给药10min后,与Aβ_(25-35)(50μmol/L)共同孵育48h,采用MTT法、Hoechst3342、JC-1及DCFH-DA探针染色,分别检测测细胞活力、细胞凋亡、细胞内活性氧浓度及细胞膜电位的变化。结果发现,S3在10~(-6)mol/L时提高细胞活力30.8%(P<0.01);S3能以浓度依赖方式减少细胞内ROS的量,分别减少51.0%,40.2%,25.0%(P<0.01);同时,S3明显减少Aβ_(25-35)诱导的细胞凋亡和恢复Aβ_(25-35)诱导的细胞膜电位降低。因此,S3可能通过其抗氧化活性,降低ROS的产生,恢复线粒体膜电位从而保护Aβ_(25-35)对SH-SY5Y细胞的损伤作用,此作用可能与雌激素受体无关。 二.S3对小鼠侧脑室注射Aβ_(25-35)诱导神经损伤的保护作用 采用Aβ_(25-35)侧脑室注射诱导小鼠神经损伤,观察S3对实验动物AD模型小鼠神经损伤保护作用。小鼠给药1周后,侧脑室注射Aβ_(25-35)通过Morris水迷宫和TUNEL免疫组化方法检测小鼠学习记忆能力和海马区神经细胞凋亡,同时通过比色法检测海马和皮质中AchE、ChAT、SOD酶活性。结果发现,S3能改善侧脑室注射Aβ_(25-35)导致的记忆损伤及海马区的神经元凋亡。此外,S3在50mg/kg/d能明显提高皮质和海马区SOD和ChAT酶活性(P<0.05),并降低AchE酶活性(P<0.05)。因此,S3可能是通过增加SOD活性,清除自由基,并上调ChAT、下调AchE活性从而提高中枢系统乙酰胆碱水平,并减少神经细胞凋亡,从而达到改善模型小鼠空间学习能力。 三.S3对高脂+侧脑室注射Aβ_(25-35)诱导大鼠记忆缺陷的保护作用 采用高脂+Aβ_(25-35)侧脑室注射诱导神经损伤,观察S3对高脂+Aβ_(25-35)侧脑室注射大鼠神经保护作用。大鼠经高脂饲料喂养45d后,侧脑室注射Aβ_(25-35)同时给予S3和E_2。通过Morris水迷宫和跳台实验评价大鼠的学习记忆能力,TUNNEL免疫组化方法检测神经细胞凋亡。此外,通过比色法检测海马组织中SOD、GSH-PX、AchE、ChAT酶活性及MDA含量。同时,通过Elisa方法法和WB法检测了海马组织Ach水平和Cyto-C的释放。结果发现,S3能改善高脂+侧脑室注射Aβ_(25-35)诱导神经损伤大鼠的学习记忆能力。乙酰胆碱是参与学习记忆非常重要的神经递质,我们发现S3能明显升高海马组织中乙酰胆碱含量(P<0.05),同时发现S3上调ChAT(P<0.01)和下调AchE(P<0.05)的活性,因此,S3可能通过上调ChAT和下调AchE的活性并升高海马组织中乙酰胆碱含量,从而提高模型大鼠的学习记忆能力。此外发现,S3减少Aβ_(25-35)诱导的神经元凋亡,同时发现S3能减少MDA的生成(P<0.05)、抑制cyto-c(P<0.01)释放从而抑制凋亡信号,减少神经细胞的凋亡。此作用可能与S3能提高GSH-PX(P<0.05 vs)和SOD(P<0.05)酶活性有关。因此,S3可能通过上调GSH-PX和SOD酶的活性,抑制脂质过氧化,保护线粒体膜,减少cyto-C释放,抑制凋亡信号的产生,从而减少神经细胞的凋亡。同时,提高ChAT酶活,降低AchE酶活性,提高中枢Ach水平,从而改善大鼠的学习记忆能力。 四.S3对去卵巢大鼠皮质、海马AQP1、AQP4表达的影响 采用去卵巢大鼠,观察S3对去卵巢大鼠海马和皮质中QP1、AQP4的表达的影响。大鼠去卵巢4周,给药12周,采用放免法检测血清中激素水平,采用Elisa法检测皮质和海马中QP1、AQP4的表达。结果发现,S3能上调去卵巢大鼠血清中雌激素水平(P<0.01),下调血清中FSH、LH水平(P<0.05),下调皮质、海马中AQP1、AQP4的表达(P<0.01)。表明S3可能参与去卵巢大鼠中枢系统的物质转运。 五.S3初步安全性实验 采用MTT方法,评价S3对MCF-7细胞增殖的影响,同时,大剂量S3灌胃,观察S3的急性毒性。 研究发现,S3能抑制MCF-7细胞增殖,此作用可能与激活β雌激素受体有关;S3给予最大给药量10g/Kg时,小鼠观察2周依然安全。因此S3为低毒性。 综上所述,本课题首次分别从体内,体外实验探讨了S3对神经细胞的保护作用,并建立了两种不同AD动物模型,验证了木豆叶芪类成分及其合成类似物S3改善AD模型大、小鼠的学习记忆能力和对神经细胞的保护作用,并初步探讨了其作用机理。在此基础上还发现S3可以改善高脂饲料喂养大鼠的血脂异常,改善胆固醇代谢紊乱及下调去卵巢大鼠海马和皮质AQP1、AQP4的表达。此外还发现S3安全性比较高,毒性较低的特点。因此,我们认为S3可以开发为神经保护剂和降脂药,可用于老年痴呆及高脂血脂患者的治疗。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R749.16

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