布格呋喃与CYP450/P-糖蛋白的相互作用及生物学效应

【摘要】： 药物代谢是新药研究过程中必不可少的重要环节,口服药物的生物利用度和药物相互作用是评价药物代谢特征的重要指标。已知在药物代谢过程中,当两种或多种药物经同一代谢酶代谢时,药物间则可能由于对药酶的竞争而发生相互作用,致使血药浓度显著增加,导致严重的不良反应。此外,药物进入体内在受到药酶代谢转化的同时,也可诱导或抑制某些CYP450同工酶的表达水平和代谢活性,从而调节自身和其它化合物的代谢转化,以致改变新药的安全性和疗效。因此,在新药研发的临床前阶段明确药物的主要代谢途径以及对药酶的诱导和抑制,对于认识个体间代谢差异和预测潜在的药物-药物相互作用具有重要意义,此外,还有助于明确某些代谢产物的药理学特隆和进一步开发的价值。 P-糖蛋白是一类ATP依赖性膜蛋白,在小肠粘膜、血脑屏障、肝细胞、肾及睾丸等器官均有分布,是上述生理屏障的重要组成部分并发挥泵出作用,阻碍某些有害物质进入这些特定部位,同时也可加快药物从这些组织部位的消除,从而影响药物的吸收、分布、代谢和排泄。药物对上述器官P-糖蛋白的调控可引发非代谢性的药物相互作用。因此,有必要在新药研发阶段关注药物与P-糖蛋白之间的相互影响。 虽然肝脏是人体最主要的代谢器官,参与大多数药物和毒物的生物转化,但除肝脏之外,肠道和肾脏作为吸收和排泄器官也表达部分CYP同工酶和转运蛋白,在药物代谢中的作用同样不可忽视。 布格呋喃是由中国医学科学院药物研究所研发的抗焦虑新药。前期体内药代动力学结果显示,大鼠口服布格呋喃后具有半衰期短,生物利用度较低,靶器官分布少的特点。布格呋喃可经CYP450代谢,同时也是肠道P-糖蛋白的底物,但参与布格呋喃代谢的同工酶亚型、布格呋喃与CYP450以及P-糖蛋白相互作用的分子机制和由此产生的生物学效应还有待进一步明确。为此,本研究可分为以下几方面内容：1.采用大鼠、人肝微粒体和重组人源CYP450同工酶温孵法,应用GC-MS分析技术,研究参与布格呋喃Ⅰ相代谢的同工酶类型和产物生成的相关性。2.从酶活性水平、mRNA转录水平和蛋白表达水平评价多次口服不同剂量布格呋喃对大鼠肝脏CYP的调控作用。3.应用探针底物法、RT-PCR、western-blotting方法从细胞、亚细胞组分、mRNA和蛋白水平考察布格呋喃对小肠CYP3A、P-糖蛋白和肾CYP2C11、2E1以及P-糖蛋白的影响。4.应用整体动物、原位脑灌流模型及构建P-糖蛋白高表达MDCK细胞株研究P-糖蛋白对布格呋喃脑分布以及多次口服布格呋喃对脑P-糖蛋白的影响。5.根据布格呋喃对药物代谢酶和外排蛋白的研究结果,选取可能与布格呋喃合用的四种临床药物,考察布格呋喃与其他药物合用对药代动力学的影响。研究结果表明： 一、布格呋喃在大鼠／人肝脏微粒体主要代谢产物鉴定及比较 1.1本研究应用的GC-MS分析方法可有效分离布格呋喃在微粒体温孵体系中的代谢产物并初步鉴定其结构类型。 1.2布格呋喃在大鼠肝微粒体中可代谢为一羟基、一羰基和二羟基代谢产物。布格呋喃在人肝微粒体中的代谢特征与大鼠相似,同样生成一羟基、一羰基和二羟基类型代谢产物,但代谢速率较大鼠慢,生成的代谢产物种类较大鼠中少。 1.3应用CYP同工酶选择性抑制剂研究结果显示,在肝微粒体加入CYP3A4和CYP2E1的抑制剂酮康唑和戒酒硫后,布格呋喃消除速率减慢,各代谢产物生成量明显减少。体外重组人源CYP3A4和CYP2E1温孵结果表明,布格呋喃在重组人源CYP3A4中可迅速被代谢,代谢产物主要为一羰基和二羟基产物。综合以上结果,可初步判断CYP3A4是参与布格呋喃代谢的主要CYP同工酶,一羰基和二羟基化是其催化的主要反应。 二、布格呋喃对大鼠肝脏CYP450s的调控 2.1布格呋喃(4、16、64 mg/kg,1次／日×7)多次给药可提高大鼠肝脏CYP1A2和2E1活性、基因和蛋白表达水平也明显增加,并呈一定剂量-效应关系,但诱导强度弱于经典诱导剂β-萘黄铜和乙醇。 2.2多次口服布格呋喃可抑制大鼠肝脏CYP2D活性,对CYP2C6和CYP2C11活性均有一定程度的诱导作用,但对CYP3A活性无明显影响。 2.3布格呋喃在自身处理的肝微粒体中代谢速率有所提高,提示布格呋喃诱导自身代谢与其对肝脏药物代谢酶的诱导有关。 2.4布格呋喃在浓度为1-10μM时对CYP450同工酶存在不同程度抑制作用,但浓度降为0.5gM时对CYP450同工酶则无显著性影响。 三、布格呋喃对大鼠肠道和肾脏主要CYP450s和P-糖蛋白的调控 3.1布格呋喃可上调大鼠小肠CYP3A的催化活性和蛋白表达,诱导人源肠道LS-174T细胞CYP3A4蛋白含量升高,提示布格呋喃可通过调控小肠CYP3A蛋白含量提高其的催化活性。同时,布格呋喃亦可上调肠道P-糖蛋白含量。应用Caco-2细胞Transwell模型研究发现,布格呋喃100μM处理72h可明显降低地高辛在Caco-2单层细胞的渗透系数,同时增加其外排系数,此改变可被P-糖蛋白抑制剂环孢菌素所逆转；另一方面,布格呋喃100μM可抑制P-糖蛋白对地高辛的外排。以上结果提示,布格呋喃可诱导／抑制肠道P-糖蛋白功能。 3.2布格呋喃多次口服可上调肾脏CYP2C11、2E1和P-糖蛋白的水平,并且对肾CYP2E1的上调倍数大于肝脏。 四、布格呋喃与大鼠脑P-糖蛋白的相互作用 4.1应用大鼠原位脑灌流模型研究发现,布格呋喃在脑中的分布在0-8min内呈线性增加；P-糖蛋白抑制剂环孢菌素可使布格呋喃自血液向脑组织的单向转运明显增加,提示布格呋喃是脑P-糖蛋白的底物,血脑屏障中的P-糖蛋白可对布格呋喃脑分布产生阻碍作用。 4.2应用RT-PCR、western blot和罗丹明脑-血分布方法检测大鼠脑MDR1基因的mRNA和P-糖蛋白表达及功能发现,多次口服布格呋喃可上调P-糖蛋白表达和功能。 五、布格呋喃对联合用药的药代动力学影响研究 5.1非那西丁为常用解热镇痛药,体内主要经CYP1A2代谢生成代谢产物扑热息痛。当布格呋喃与非那西丁联合用药时,单次给予布格呋喃组非那西丁AUC、峰浓度升高,清除率下降,而其代谢产物扑热息痛的AUC和达峰浓度均有所下降；多次给药组非那西丁的AUC下降,MRT减小,而清除率提高,同时扑热息痛的AUC和峰浓度均较对照组升高。以上结果与布格呋喃对肝脏CYP1A2的诱导／抑制相关。 5.2氯唑沙宗是中枢性肌松剂,在体内主要经CYP2E1代谢。体内药代动力学结果表明,多次口服布格呋喃组氯唑沙宗的AUC下降,MRT减小,清除率提高,而6-羟基氯唑沙宗的AUC和峰浓度均较对照组升高,提示布格呋喃多次给药可在一定程度上加快氯唑沙宗的消除,可能与对肝脏CYP2E1的诱导密切相关。但单次给予布格呋喃组氯唑沙宗各药代动力学参数无显著性变化,说明布格呋喃单次口服对氯唑沙宗体内过程影响不大。 5.3咪达唑仑属于苯二氮卓类镇静催眠药,主要由CYP3A同工酶代谢,其清除率主要取决于CYP3A活性。大鼠体内药代动力学研究结果表明,口服布格呋喃后咪达唑仑达峰浓度提高,推测与前述布格呋喃对CYP3A的体外抑制作用有关。而多次口服布格呋喃的大鼠表现为咪达唑仑体内AUC、达峰浓度显著降低,清除大大加快,但相应体内代谢产物也减少,提示其体内代谢还有其它因素参与。据报道,咪达唑仑是CYP3A和P-糖蛋白共同的底物,布格呋喃多次给药对小肠P-糖蛋白也有诱导作用,当两药合用时,布格呋喃可通过诱导P-糖蛋白减少咪达唑仑的吸收,导致其血药浓度降低,同时代谢产物减少。 5.4地高辛为一种中效强心苷,为P-糖蛋白的底物,治疗安全范围较小,毒性反应严重时会危及生命。前期研究表明,布格呋喃对P-糖蛋白有诱导／抑制作用,因此本文对二者合用时地高辛的血药浓度进行了监测。实验结果表明,布格呋喃单次口服可明显升高地高辛血药浓度(峰浓度升高约25%,AUC升高85%),因此两药合用时,注意避免出现毒副作用。布格呋喃多次给药可使地高辛达峰浓度和AUC分别降至对照组的70%和80%,提示在长期服用布格呋喃后使用其他P-糖蛋白的底物药应注意药效学的监控。 综上所述,本文应用体外亚细胞组分、细胞、在体器官和整体动物模型,较系统地研究了布格呋喃对肝脏、小肠、肾、脑CYP同工酶和P-糖蛋白的诱导和抑制以及参与其代谢的主要CYP450同工酶,并研究了布格呋喃对合用药体内药代动力学的影响。上述研究不仅可阐明布格呋喃与CYP450和P-糖蛋白相互作用的分子机制,同时为预测临床药物相互作用和合理用药、针对药代特性进行新药的结构改造提供科学依据。