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《中国协和医科大学》 2009年
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一、Spike蛋白来源B细胞表位多肽及抗体在SARS冠状病毒感染中作用机制研究 二、EV71病毒基因工程亚单位疫苗的制备及鉴定

贾春实  
【摘要】: 严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)是由SARS冠状病毒(SARS-CoV)引起的急性呼吸道传染病。SARS传播速度快、范围广、死亡率高,被称为21世纪初最烈性的传染病之一。SARS是由冠状病毒家族的新成员-SARS冠状病毒(SARS-CoV)引起,它既不是任何一种已知冠状病毒的突变体,也不是已知冠状病毒的重组体,是一种未知的冠状病毒。该病病死率较高,尤其是65岁以上的老人可超过50%。SARS病毒作为一种新的冠状病毒,其毒力远远超过其它已知的家族成员,目前尚无有效治疗SARS的抗病毒药物。人们普遍认为,研制一种安全有效的疫苗、开展人群免疫预防是阻止SARS再次流行最有效的方式。目前,已出现多种有发展前景的SARS-CoV疫苗形式,包括灭活病毒疫苗、基于SARS-CoV结构蛋白制备的DNA疫苗、活病毒载体疫苗等,表位疫苗是近年来新近发展起来的疫苗形式,安全性好,诱导的免疫反应针对性强。在我们的研究中,利用SARS-CoV Spike蛋白来源B细胞表位多肽及其产生的单克隆抗体在SARS-CoV感染细胞及体内的过程中进行作用,对其作用效应加以描述,同时对其作用机制加以探讨,以期对SARS-CoV疫苗的研制工作提供有力的科学依据。 本研究中,我们首先在体外利用SARS-CoV Spike蛋白来源的四种B细胞表位多肽所产生的单克隆抗体在SARS-CoV感染Vero-E6细胞时进行作用,在筛选得到对病毒感染有中和作用抗体的同时,发现其中由S(597-625)多肽所制备的单克隆抗体S(597-625)43-3-14在病毒感染的过程中表现出随抗体浓度增加而细胞受感染增强的现象。随后我们对四种多肽进行不同组合,先后免疫了h-ACE2转基因C57小鼠及恒河猴,经检测动物体内特异性抗体达到稳定水平后,进行SARS-CoV感染,分别于攻毒后2天与6天时间点安乐动物,观察SARS-CoV作用靶器官肺组织的病理学变化及肺组织内SARS-CoV载量,发现仍然是由S(597-625)多肽免疫的C57小鼠或恒河猴攻毒后在肺组织病理学改变上表现出严重的肺间质性肺炎症状,病毒载量较对照组及其它免疫组增加。根据该实验结果,我们又设计应用高、低两组浓度的S(597-625)43-3-14抗体静脉注射于恒河猴体内,攻毒后仍选择相同的时间点安乐恒河猴观察病理学变化及肺组织的SARS-CoV载量,发现肺组织病理性损伤程度及病毒载量随抗体浓度的升高而增加,说明S(597-625)43-3-14抗体在体外及体内都可以增强SARS-CoV的感染。 本研究提示,在病毒感染过程中,可能存在一种通过抗体介导的独立于Fc片段受体之外的非经典ADE机制,当体内已经存在抗体或抗体结合力较低的情况下,这种ADE现象可以减弱、平衡掉其它中和抗体的作用甚至增强病毒的感染。尽管ADE的作用机制未被完全阐明,但是这种作用可被认为是研发预防各种感染的疫苗的一个最大障碍,而我们的研究将为SARS-CoV疫苗的研究及评价提供严谨有力的科学依据。 手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)是以手掌、脚掌、口腔黏膜上发生水疱为特征的一种病毒性皮肤病,其病原体以柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16, CoxAl6)和人肠道病毒71型(human enterovirus 71, EV71)最为常见,埃可病毒和其他一些肠道病毒亦可致病。疾病进程为自限性,一般预后良好,少数病例可引发心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等严重并发症甚至死亡。我国手足口病感染流行的全局性情况、病毒流行株的地区分布及变异性等都还有待进一步查明。2000-2005年,金奇等连续6年对深圳的手足口病流行情况进行监测,结果发现,2/3的病例是由CAl6病毒感染引起,1/3由EV71病毒感染导致。而2007年在山东局部流行的手足口病70%的病例是EV71病毒感染,CoxA16病毒感染只占总数的20%左右 全国今年已报告手足口病115618例,死亡50例。卫生部新闻办公室主任邓海华指出,2009年3月全国通过传染病网络直报系统报告的手足口病病例是54713例,死亡31例。从今年年初到4月7号,网络直报显示,全国累计报告手足口病例115618例,其中重症773例,死亡50例。 EV71病毒感染多呈隐性,显性表现中,一般病例感染后进入HFMD/疱疹性咽峡炎阶段,在原发病的基础上,少数患者可累及神经系统、呼吸系统和循环系统。神经源性肺水肿(neurogenic pul-monary edema, NPE)病死率高,是EV71病毒感染的重要并发症和主要死因,也是本次阜阳市疫情中部分重症患儿的主要死因,表现为起病第1~3天内突然发生心动过速、呼吸困难、紫绀和休克,胸片显示双侧对称性非心源性肺水肿,90%病例于发病后12h内死亡[66],其严重性值得关注。 手足口病严重影响青少年儿童的身心健康,除要加强人群本身的健康状况,提高自身免疫力,以有效抵御病毒的侵袭外,启动EV71病毒疫苗的研制工作将成为手.足口病防治的重中之重。 我们利用安徽阜阳来源的病毒,作为疫苗制备的模版,根据NCBI已测序的EV71毒株-EU701832序列,将病毒的2193个氨基酸依次分割成含100~150个氨基酸的肽段进行表达。表达后的肽段作为抗原进行免疫学观察,并对抗原刺激机体产生的抗体进行免疫学检测及细胞保护性实验。结果表明1#,5#,6#,7#,10#,13#,14#,18#,19#,20#抗原效果最佳,可以作为下一步动物保护性实验候选疫苗。其中1#抗原属于VP4蛋白,5#、6#抗原属于VP3蛋白,7#抗原属于VP1蛋白,10#抗原属于2A蛋白,13#、14#抗原属于2C蛋白、18#抗原属于3C蛋白,19#、20#属于3D蛋白。我们决定应用1#,5#,6#,7#,10#,13#,14#,18#,19#,20#10个抗原,作为疫苗组合的基础单位,进行三三融合,增加抗原的免疫效应。 综上,我们的工作为接下来进行的抗原肽段动物保护性实验及今后的EV71病毒疫苗制备及鉴定工作打下坚实的理论基础,提供了科学的实验依据。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R392

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